[发明专利]一种用于体外替代测试的全层皮肤模型及其制备方法

权利要求书

1.一种用于体外替代测试的全层皮肤模型，其特征在于：具有三层皮肤结构，自上而下分别为表皮层，真皮层和脂肪层；

所述表皮层由表皮细胞生发复层化组成；

所述真皮层由成纤维细胞及其胞外基质组成；

所述脂肪层由脂肪间充质干细胞经诱导而成的脂肪细胞及胞外基质组成。

2.如权利要求1所述的用于体外替代测试的全层皮肤模型，其特征在于：

所述表皮层的厚度为150～200μm；

所述真皮层的厚度为40.0～60.0μm；

所述脂肪层的厚度为10.0～20.0μm。

3.一种权利要求1或2所述用于体外替代测试的全层皮肤模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、脂肪层的构建

1.1）、将P3～P8代的脂肪间充质干细胞消化后，于800～1000rpm/min条件下离心5～8min；在含体积比为5～10%胎牛血清FBS的α-MEM培养基中重悬,以每孔0.12E6～0.25E6密度接种至Transwell小室，保持该Transwell小室内的液量为150～200μl，在4.5%～5.5%CO₂、37±1℃的孵箱中培养；

1.2）、18～24h后弃去所述Transwell小室内外的α-MEM培养基，加入成脂诱导液，保持所述Transwell小室内液量150～200μl，在4.5%～5.5%CO₂、37±1℃的孵箱中培养5～7d，每隔2～3d换液；

1.3）、5～7d后，重复步骤1.1），18～24h后更换所述Transwell小室内外培养液为成脂诱导液，保持所述Transwell小室内液量150～200μl，在4.5%～5.5%CO₂、37±1℃孵箱中培养2～4d，每隔18～24h更换所述Transwell小室内液体，保持所述Transwell小室内液量150～200μl；

所述成脂诱导液的组成：以α-MEM培养基作为基础液，其中添加体积比分别为5～10%的胎牛血清FBS，吲哚美辛0.01～0.05mg/ml，IBMX0.1～0.5mg/ml，胰岛素0.01～0.05mg/ml，地塞米松0.1～0.8μg/ml；

步骤二、真皮层的构建：

2.1）、P6～P10代成纤维细胞消化后，于800～1000rpm/min条件下离心5～8min；在含有25～75μg/mlVc以及体积比为5～10%的胎牛血清FBS的α-MEM培养基中重悬,以每孔0.12E6～0.25E6密度接种至步骤一制备的脂肪层，保证所述Transwell小室内液量150～200μl，在4.5%～5.5%CO₂、37±1℃的孵箱中培养；

2.2）18～24h后，重复步骤2.1），在4.5%～5.5%CO₂、37±1℃的孵箱中培养2～4d，每隔18～24h换液，保证所述Transwell小室内液量150～200μl；

步骤三、表皮层的构建：

3.1）、待P4～P8代表皮细胞培养融合率达60～70%左右时，于800～1000rpm/min条件下离心6～8min，用构建培养液SKc1重悬，以1.5～3.0E5/孔的细胞密度接种至步骤二制备的真皮层中；其中，SKc1阶段为液下培养方式，保证所述Transwell小室内液量150～200μl，于4.5%～5.5%CO₂、37±1℃的孵箱中培养，每18～24h换液一次；

3.2）、培养2～3d后，更换成构建培养液SKc2，并进行气液面培养，将步骤3.1）中Transwell小室的培养液吸去，保持人工皮肤表面的干燥，随后在4.5%～5.5%CO₂、37±1℃的孵箱中培养2～3d，每18～24h换液一次；

3.3）、2～3d后，更换成构建培养液SKc3，并进行气液面培养，在4.5%～5.5%CO₂、37±1℃的孵箱中培养2～3d，每18～24h换液一次；

3.4）、2～3d后，更换成构建培养液SKc4，并进行气液面培养，在4.5%～5.5%CO₂、37±1℃的孵箱中培养1～2d，每18～24h换液一次；

不同构建培养液所含成分具体如下：

构建基础培养基为DMEM；

所述构建培养液SKc1是在DMEM培养液中添加体积比分别为5～10%的胎牛血清FBS，0.1～0.5ng/ml的EGF，0.1～0.8μg/ml的地塞米松，3～25μg/L的胰岛素INSULIN，15～45μg/ml的腺嘌呤，0.1～0.5nM的ThyroxineT3,4～10μg/ml的维甲酸；

所述构建培养液SKc2是在DMEM培养液中添加体积比分别为5～10%的胎牛血清FBS，添加0.25～0.5mM的CaCl₂，0.1～0.5ng/ml的EGF，25～75μg/ml的Vc，0.1～0.8μg/ml的地塞米松，3～25μg/L的胰岛素INSULIN，15～45μg/ml的腺嘌呤，0.1～0.5nM的ThyroxineT3，4～10μg/ml的维甲酸；所述构建培养液SKc3是在DMEM培养液中添加体积比分别为5～10%的胎牛血清FBS，添加0.5～1mM的CaCl₂，0.1～0.5ng/ml的EGF，25～75μg/ml的Vc，0.1～0.8μg/ml的地塞米松，3～25μg/L的胰岛素INSULIN，15～45μg/ml的腺嘌呤，0.1～0.5nM的ThyroxineT3，4～10μg/ml的维甲酸；所述构建培养液SKc4是在DMEM培养液中添加体积比分别为5～10%的胎牛血清FBS，添加1～1.5mM的CaCl₂，0.1～0.5ng/ml的EGF，0.1～0.8μg/ml的地塞米松，3～25μg/L的胰岛素INSULIN，15～45μg/ml的腺嘌呤，0.1～0.5nM的ThyroxineT3，4～10μg/ml的维甲酸。