[发明专利]一种提高花青素含量的方法

权利要求书

1.柑橘八氢番茄红素合成酶基因用于转入草莓中以提高草莓花青素含量的用途。

2.一种提高草莓花青素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建柑橘八氢番茄红素合成酶基因表达质粒；

2)利用农杆菌介导法将步骤1)构建的柑橘八氢番茄红素合成酶基因表达质粒转入草莓中，获得转柑橘八氢番茄红素合成酶基因的草莓；

3)将转柑橘八氢番茄红素合成酶基因的草莓进行分子生物学鉴定；

4)检测表达柑橘八氢番茄红素合成酶基因的草莓中花青素的含量；

5)转入柑橘八氢番茄红素合成酶基因的草莓中花青素代谢相关基因表达量检测。

3.根据权利要求2所述一种提高草莓花青素含量的方法，其特征在于，步骤2)所述获得转柑橘八氢番茄红素合成酶基因的草莓的方法包括以下步骤：

21)制备草莓无菌试管苗材料；

22)制备接种用的草莓外植体；

23)利用叶盘法农杆菌介导法转化。

4.根据权利要求3所述一种提高草莓花青素含量的方法，其特征在于，步骤23)所述利用叶盘法农杆菌进行转化具体包括以下步骤：

a)将含有柑橘八氢番茄红素合成酶基因表达质粒的农杆菌划线培养；

b)将草莓外植体于固体外植体再生培养基暗培养，得到叶盘；

c)取步骤a)的单菌落接种于含有抗生素的液体培养基中进行培养；

d)取步骤c)中培养的菌液接种到不含有抗生素的液体培养基中，扩大培养；

e)取步骤d)培养的菌液离心，弃上清，重悬；

f)将步骤b)培养的叶盘于无菌条件下悬浮备用；

g)将步骤f)中用于悬浮的液体滤出，向叶盘中加入步骤e)重悬的菌液，摇动，滤出菌液，将叶片多余菌液吸干后，接于固体的外植体再生培养基上进行共培养,所述共培养为暗培养，之后进行推迟筛选，所述推迟筛选也为暗培养；

h)将推迟筛选后的叶片接于筛选培养基；

i)进行暗培养至叶片长出愈伤组织后转入光照培养，筛选抗性芽；

j)将筛选培养后得到的抗性芽切下，接在含有抗生素的植株继代培养基中培养，当芽体长出并出现小叶片后，移至含有抗生素的生根培养基中诱导生根；

上述步骤c)、j)中所述的抗生素的抗性与柑橘八氢番茄红素合成酶基因表达质粒所携带的抗性基因抗性一致。

5.根据权利要求4所述一种提高草莓花青素含量的方法，其特征在于，步骤g)中，所述外植体再生培养基是以MS培养基为基础，添加终浓度为1.5mg/L的脱叶灵和终浓度为0.2mg/L的吲哚丁酸。

6.根据权利要求4所述一种提高草莓花青素含量的方法，其特征在于，步骤g)中，共培养时间为3d，推迟筛选的时间为7-14d。

7.根据权利要求4所述一种提高草莓花青素含量的方法，其特征在于，步骤h)中，所述筛选培养基是以MS培养基为基础，添加终浓度为1.5mg/L的脱叶灵、终浓度为0.2mg/L的吲哚丁酸、终浓度为250mg/L的头孢霉素和终浓度为10mg/L的卡那霉素。

8.根据权利要求4至7任一项所述一种提高草莓花青素含量的方法，其特征在于，步骤j)中，所述含有抗生素的植株继代培养基是以MS培养基为基础，添加终浓度为0.2mg/L的6-苄基腺嘌呤、终浓度为0.02mg/L的吲哚丁酸、终浓度为0.2mg/L的赤霉素、终浓度为10mg/L的卡那霉素和终浓度为250mg/L的头孢霉素。

9.根据权利要求8所述一种提高草莓花青素含量的方法，其特征在于，步骤j)中，所述含有抗生素的生根培养基为将MS培养基稀释两倍后同时添加终浓度为0.2mg/L的吲哚丁酸、终浓度为10mg/L的卡那霉素和终浓度为250mg/L的头孢霉素。