[发明专利]一种齐考诺肽的纯化方法

说明书

本发明涉及一种齐考诺肽的纯化方法，其特征包括以下步骤：(1)使用三氟醋酸调节齐考诺肽粗品溶液pH为3‑4；(2)按体积分数设置梯度，使用50%流动相B冲洗反相填料柱10min，然后用5%流动相B等度洗脱平衡10min；(3)将(1)的溶液载入反相填料中；(4)按体积分数设置梯度，洗脱梯度的初始状态流动相B为5%，保持5分钟，然后在60分钟内将流动相B比例增至22%，收集洗脱馏分；(5)将洗脱馏分经过转盐、浓缩、冻干后得到齐考诺肽精肽。

技术领域

本发明涉及一种多肽类药物的纯化方法，尤其是一种齐考诺肽的纯化方法。

背景技术

齐考诺肽是人工合成的ω-MⅦA 芋螺毒素, 它首先作为致幻芋螺毒素的一种多肽成分被报道。它的25 个氨基酸序列为:Cys- Lys- Gly- Lys- Gly- Ala- Lys- Cys-Ser- Arg- Leu-Met- Tyr- Asp-Cys- Cys- Thr- Gly- Ser- Cys- Arg- Ser- Gly- Lys-Cys- NH₂( 1-16) ，( 8-20) ，( 15-25) -tris( disulfide)。

齐考诺肽对那些使用阿片类镇痛剂无效的严重慢性疼痛患者会产生显著的镇痛作用, 在临床研究中没有发现病人对齐考诺肽产生抗药性。目前, 齐考诺肽已成为第一种新型的神经治疗药物———N 型钙离子通道阻断剂(NCCB)。作为一种非阿片类镇痛剂, 齐考诺肽与其他镇痛药物的区别在于其临床应用的安全性和有效性,从而预示了其在严重慢性疼痛治疗中的重要的潜在价值。作为一种新型非吗啡类镇痛剂，该药物（商品名Prialt）已分别于2004年底和2005年初获得美国FDA和欧盟的上市许可。

齐考诺肽主要采用固相合成，环化而后经过制备HPLC纯化得到。有关齐考诺肽的纯化工艺，较少有研究报道。专利CN201310202089.5中主要介绍的是片段法合成齐考诺肽，提到了使用10um的C18填料色谱柱对齐考诺肽进行了纯化，专利CN200710301598.8中主要介绍的是使用不同的保护基保护巯基定向合成齐考诺肽，提到了使用C18填料色谱柱对齐考诺肽进行了纯化，专利CN201310202216.1中主要介绍的也是使用不同的保护基保护巯基定向合成齐考诺肽，提到了使用C18填料色谱柱对齐考诺肽进行了纯化。这些文献都没有对齐考诺肽的纯化工艺做进一步地研究，以适合工业化生产的要求。

由于多对二硫键的存在，给齐考诺肽的纯化带来较大困难，体现在：1.在合成齐考诺肽时，产生多种二硫键错配的杂质，这类杂质与产品很难分离，导致最终产品纯度低；2.由于多对二硫键的存在，导致齐考诺肽分子立体结构上与一般多肽差异很大，常用填料很难得到纯度较好的产品；3.多对二硫键在生产的过程中容易产生较多的多聚体，该多聚体是最主要的杂质之一，本身极不稳定，易变色，严重影响齐考诺肽的色泽、含量及安全性。本发明人经研究使用现有技术进行纯化发现，难以将多聚体杂质含量控制在0.1%以下，同时容易造成齐考诺肽收率降低。

发明内容

本发明所要解决的现有技术问题是提供了一种齐考诺肽的纯化工艺，能够很好地解决上述问题，得到高收率、高纯度的齐考诺肽，进一步地能够将多聚体杂质控制在0.1%以下，适合工业化生产。

通常使用反相高效液相色谱进行多肽纯化时，小孔径的填料的比表面积较大，纯化效果更好。但在实际应用中，我们发现含有多对二硫键的多肽在空间结构上的特殊性，导致其在小孔径的填料上所获得的有效比表面积反而比大孔径填料的有效比表面积的小，多聚体杂质不易除去，纯化效果不理想。

本发明的技术方案是提供一种齐考诺肽的纯化方法，使用了一定范围内较大孔径的填料，并在合适的制备条件下对齐考诺肽进行纯化。具体表现为，200-300Å 孔径的填料效果好，更进一步得表现为，使用300Å孔径的填料效果更好，尤其是针对多聚体杂质。

本发明中一些常用的缩写具有以下含义；

Fmoc ：芴甲氧羰基