[发明专利]原核表达重组质粒pET-IFNα、海藻酸钠包裹的干扰素及用途

权利要求书

1.原核表达重组质粒pET-IFNα，其特征在于它是通过以下方法制备的：

（1）、以草鱼RNA为模板，用反转录试剂盒进行反转录和PCR扩增，制得扩增产物；

（2）、扩增产物纯化后连接到T载体，制得连接产物；

（3）、连接产物转化至大肠杆菌DH5ɑ，筛选阳性克隆产物；

（4）、阳性克隆产物进行质粒抽提，用BamHⅠ、HindⅢ进行双酶切，酶切产物回收IFNα片段，插入原核表达载体pET-30a的多克隆位点，转化大肠杆菌DH5ɑ，然后抽提质粒进行酶切，得到重组质粒pET-IFNα；

所述反转录试剂盒的引物如下：

pET-IFNα-U：CGCGGATCCaaaactcaaatgtggacgta

pET-IFNα-L：CCCAAGCTTttatcgtctgttggcaat。

2.干扰素蛋白，其特征在于它是通过以下方法制备的：

诱导表达：权利要求1所述的原核表达重组质粒pET-IFNα转化大肠杆菌，涂布于含抗生素的平板上，培养至平板上出现单克隆菌落，挑取单克隆菌落接种于含抗生素的培养基，培养；得到含有pET-IFNα质粒的大肠杆菌菌种；

重组干扰素蛋白的纯化：将含有pET-IFNα质粒的大肠杆菌菌种接种于含抗生素的培养基，培养，加入IPTG，诱导表达；离心收集菌体，洗涤后，重悬菌体，并加入溶菌酶，超声至液体清亮，离心，分离沉淀和上清，溶解沉淀，然后经Ni-NTA亲和层析获得纯化的融合蛋白。

3.干扰素蛋白的用途，其特征在于：权利要求2所述的干扰素蛋白在制备鲤科鱼类免疫保护方面的药物的应用。

4.干扰素蛋白海藻酸钠微球，其特征在于：取权利要求2所述的干扰素蛋白，加入海藻酸钠溶液，混合均匀，作为水相；取玉米油，加入司盘-85和吐温-85，混合均匀，作为油相；在搅拌下，将水相缓慢逐滴加至油相中，搅拌，形成W/O乳剂；然后降低搅拌速度，逐滴加入离子交联剂，搅拌，然后降低搅拌速度，继续搅拌，交联固化；将乳剂转移至分液漏斗中，静置，取下层离心，分离微球，用灭菌注射用水洗涤，用灭菌注射用水混悬，得微球混悬液；取微球混悬液至容器中，加入灭菌注射用水，搅拌，逐渐滴加壳聚糖溶液，继续搅拌，离心，分离微球，用灭菌注射用水洗涤，用灭菌注射用水混悬，制得。

5.降低鲤科鱼类死亡率的方法，其特征在于：将权利要求4所述的干扰素蛋白海藻酸钠微球注射于鲤科鱼类腹腔。

6.根据要求5所述的降低鲤科鱼类死亡率的方法，其特征在于：干扰素蛋白海藻酸钠微球注射量为0.5～10μg/g鱼体重。

7.根据要求5述的降低鲤科鱼类死亡率的方法，其特征在于：干扰素蛋白海藻酸钠微球注射量为0.5～5μg/g鱼体重。

8.根据要求4所述的降低鲤科鱼类死亡率的方法，其特征在于：干扰素蛋白海藻酸钠微球注射量为1～3μg/g鱼体重。