[发明专利]一种新颖的鸽子性别鉴定方法

说明书

本发明提供了一种新颖的鸽子性别鉴定PCR方法，包括检测鸽子性别决定基因CHD‑Z和CHD‑W的特异性引物和PCR方法，利用这种方法既能够在一管内同时扩增CHD‑Z和CHD‑W的特异性片段，也可以在两管内单独扩增CHD‑Z和CHD‑W的特异性片段来验证结果，既可以用熔解曲线分析，也可以用凝胶电泳分析，方便、准确、灵活地鉴定鸽子的性别。

技术领域

本发明涉及一种采用基因检测方法鉴定鸽子等鸟类性别的方法，属于生命科学领域。

背景介绍

鸽子是一种单态性鸟，无论在幼鸟还是成鸟时期，都很难从外观形态或其他行为上区分雌雄。鸽子是一夫一妻制，母鸽需要和公鸽配对后才能繁育后代，如果能够在鸽子出生后不久就准确地进行性别鉴定，则可以大大提高配对成功率，并且及早淘汰不必要的公鸽，大大增加其经济效益，因此鸽子的性别鉴定具有重要的意义。

鸟类的性别是由染色体决定的，其性别决定方式为ZW型，雄鸟有一对Z染色体，而雌鸟则是一个Z染色体和一个W染色体。这两种染色体上都有一个CHD基因，该基因在Z染色体和W染色体上的序列具有一定差异，分别称为CHD-Z和CHD-W。由于CHD-Z和CHD-W基因在非平胸鸟类(现存鸟类中，除了鸵鸟、鸸鹋和几维鸟等走禽以外，其他都属于非平胸鸟类)中存在且具有同源性，因此可以利用该基因在Z染色体上和W染色体上的差异鉴别绝大多数的禽类，具有很大的通用性。自1995年开始，CHD基因被广泛应用于鸟类性别的分子鉴定，CHD基因已经成为非平胸鸟类性别鉴定最重要的分子标记。

传统做法采用PCR+凝胶电泳，其中最经典的P2/P8引物鉴定方法设计如下：在CHD-Z和CHD-W保守区域设计一对引物(P2/P8)，可以同时扩增CHD-Z和CHD-W基因，但扩增产物大小不同，CHD-Z的扩增片段是450bp，CHD-W的扩增片段是380bp，不同鸟类片段大小各有差别。由于不论雌鸟还是雄鸟都会有CHD-Z基因，因此是否检测到CHD-Z扩增产物可以作为扩增反应是否正常进行的参照，避免了将实验失败的结果误判为雄性；而CHD-W基因是雌性专有的，只有雌性才可能检测到CHD-W扩增。扩增结果可以简单描述为：凝胶电泳出现ZW两条带的为雌性，只出现Z一条带的为雄性，这种方法的优点是成本较低，在现有鉴定条件下被广泛地采用，缺点是操作繁琐、时间长，而且容易造成污染【参考文献1】。最近的研究表明，这两个片段虽然大小不同，但是熔解曲线温度是一样的，无法采用熔解曲线分析方法来区分。

最近几年来，有人开始采用实时荧光PCR+熔解曲线分析的方法，重新设计了引物和检测方法，利用CHD-W和CHD-Z扩增产物的熔解温度(以下简称Tm值)不同来区分ZW条带【参考文献2】。但CHD-Z和CHD-W扩增反应是分别在两个PCR反应管中进行的，一是增加了经济成本，实用性较低；二是可能发生误判，例如，操作者在Z反应管内加入样本，而W反应管则因疏忽或移液器漏气而未加入样本，则会造成雌性样本误判出雄性结果。

最新报道是在一管内用相同的引物扩增CHD-W和CHD-Z，利用扩增片段中Z和W具有3个SNP，导致的扩增产物的熔解温度(Tm值)不同来进行区分，由于只采用了一对引物，且所产生的片段序列和大小非常接近，无法用凝胶电泳区分【参考文献3】。这样的设计带来的问题是：1.没有熔解曲线分析仪的用户无法采用；2.由于无法分成两管单独扩增CHD-Z和CHD-W片段，缺乏简单有效的方法验证结果。

既能够在一管内同时扩增CHD-Z和CHD-W的特异性片段，又可以在两管内单独扩增CHD-Z和CHD-W的特异性片段来验证结果，既可以用熔解曲线分析，也可以用凝胶电泳将这两个扩增产物清晰地区分开来的方法，目前还没有报道。这正是本发明所解决的问题。

参考文献

1.贾晓旭等，利用羽毛对鸽子进行分子性别鉴定[J].农业生物技术学报，2010，18(5)：1019-1023