[发明专利]一种基于Pacbio RS II测序平台的HLA分型方法

说明书

本发明公开了一种基于Pacbio RS II测序平台的HLA分型方法，采集样本提取DNA，并进行PCR扩增，将PCR产物混合建10k文库，进行PacBio RS II测序；然后对测序得到的原始数据进行校正，利用软件程序进行HLA分型。相比于现有的HLA分型方法，本发明的HLA分型方法具有超高的分辨率，对临床移植组织配型、群体遗传学、人类学和进化学等应用和基础研究工作具有重要价值。

技术领域

本发明涉及基因测序技术领域，特别涉及HLA基因测序分型方法，具体涉及一种基于第三代测序仪PacBio RSII的测序产生的HLA-A、HLA-B、HLA-C全长基因进行分型的方法，主要用来超高分辨地对HLA基因进行型别划分。

背景技术

人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)系统是人类主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex，MHC)的别称，是人体内与免疫最相关的一段基因组区域。它位于人类6号染色体短臂，由一系列紧密连锁的基因座构成。HLA基因在人类基因组中基因多态性最高，个体之间的HLA型别差异度非常大。HLA基因具有识别自体与非体，调节免疫应答等作用。在医学上，匹配上正确而又高精度的HLA型别对骨髓移植、器官移植是否成功起着决定性的作用，并且研究发现许多疾病(例如：强直性脊椎炎(AnkylosingSpondylitis，AS))都与HLA基因的某些型别相关。有研究发现在人类交往中，HLA在异性吸引以及成功繁殖后代也起作用。

目前的HLA分型方法主要有HLA血清型分型、细胞学分型，但是分辨率很低，且实验操作繁琐。后来发展PCR分型方法，主要有单链构象多态性、限制性片段长度多态性、序列特异性引物、序列特异性寡核苷酸探针，虽然分辨率有所提高，但是同样操作麻烦，成本高。最近发展起来的基于第二代测序技术的PCR-SBT精度提高到高分辨率，价格也有所降低。然而第二代测序技术也存在问题，主要是无法把HLA基因全部测通，还是局限在2、3、4号外显子，内含子以及UTR区域的序列无法得到信息。

HLA型别不断增长，已经达到12,242个(IMGT/HLA数据库)，而测序手段仍然局限于2、3、4号外显子，精度不高，而且很多情况下等位基因无法分开。因此我们利用新的三代测序技术进行全长测序(1-7号外显子以及内含子，UTR区域)，并且用我们开发的程序进行超高分辨率的HLA分型。

发明内容

针对现有HLA测序分型技术存在的不足，本发明的目的在于利用新的三代测序技术进行全长测序，包括1-7号外显子以及内含子、UTR区域，并且开发分型程序进行超高分辨率的HLA分型。

本发明的技术方案如下：

一种基于Pacbio RS II测序平台的HLA分型方法，包括以下步骤：

1)采集样本提取DNA，然后进行PCR扩增，其中PCR扩增所用引物是针对需要分型的HLA基因的5’UTR和3’UTR区域设计的，且每对引物的5’端都加有用于区分样本的Barcode(条形码)序列；

2)将步骤1)得到的PCR产物混合建10k文库，然后进行PacBio RS II测序；

3)对测序得到的原始数据进行校正，得到高质量的CCS reads，并根据barcode序列和引物信息把不同样本的不同HLA基因的reads序列分开；

4)采用软件程序进行HLA分型，包括：

4-1)根据等位基因上的特异性位点将各样本的各HLA基因的reads序列分成两份文件，一份为等位基因1，另一份为等位基因2；

4-2)对各等位基因的文件分别截取20～40条reads进行序列组装；

4-3)校正组装结果；