[发明专利]一种基于核糖体DNA ITS2基因检测华支睾吸虫囊蚴的PCR扩增试剂盒及扩增引物

说明书

技术领域

本发明涉及寄生虫检测技术领域，特别涉及一种基于核糖体DNITS2基因检测华支睾吸虫囊蚴的PCR扩增试剂盒及扩增引物。

背景技术

华支睾吸虫病(Clonorchiasis)是由于感染华支睾吸虫(Clonorchissinensis，Cs)引起的食源性人兽共患寄生虫病，严重危害人类的健康。该病主要分布在东亚、东南亚和东欧的部分国家，如中国、韩国、老挝和越南等。据统计全球约有3500万人感染这种吸虫，其中1500万人分布在我国的各个省市区(除内蒙古、青海、西藏和新疆外均有发现)，以广东、广西和东北三省尤为严重。目前，华支睾吸虫的鉴定方法还没有统一的标准，目前对华支睾吸虫囊蚴的诊断依赖于显微镜检查。众所周知，显微镜检查耗费时间长，检查效率低，对检查者临床工作经验要求较高，而且对于与华支睾吸虫亲缘关系相近的囊蚴，虫卵形态相似，普通光镜无法区分，使用这种方法往往会出现误判。免疫诊断法虽然较显微镜检查法效率高，但也常常为灵敏度和特异性所局限。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于核糖体DNAITS2基因检测华支睾吸虫囊蚴的PCR扩增试剂盒，灵敏度高，特异性强，检测快速、准确，为华支睾吸虫感染的诊治和预防提供有效的技术手段。

本发明还提供了一种基于核糖体DNAITS2基因检测华支睾吸虫囊蚴的扩增引物，特异性强。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种基于核糖体DNAITS2基因检测华支睾吸虫囊蚴的PCR扩增试剂盒，包括PCR扩增反应液，所述PCR扩增反应液包括：Tris-HCl10mmol/L，KCl50mmol/L，MgCl₂1.5mmol/L，dNTPs0.8mmol/L，正向引物0.4μmol/L，反向引物0.4μmol/L，DNA模板20ng/μL，Taq酶0.075U/μL。

本发明以华支睾吸虫核糖体DNA内转录间隔区(ITS)基因-ITS2为目标，专门设计了针对性的特异性引物，进一步的设计了检测试剂盒，检测结果特异，结果易判断，灵敏度高，特异性强，检测快速、准确，为华支睾吸虫感染的诊治和预防提供有效的技术手段。

作为优选，所述正向引物序列为：5'-ATAAACTATCACGACGCCCAA-3'(SEQIDNO.1)。

作为优选，所述反向引物序列为：5'-GGTGCAAAACAGATTTGCATC-3'(SEQIDNO.2)。

作为优选，所述Tris-HCl的pH为8.3。

一种基于核糖体DNAITS2基因检测华支睾吸虫囊蚴的扩增引物所述扩增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物序列为：所述正向引物序列为：5'-ATAAACTATCACGACGCCCAA-3'(SEQIDNO.1)，所述反向引物序列为：所述反向引物序列为：5'-GGTGCAAAACAGATTTGCATC-3'(SEQIDNO.2)。采用本发明设计的特异性扩增引物，检测灵敏度高，特异性强。

本发明的有益效果是：灵敏度高，特异性强，检测快速、准确，为华支睾吸虫感染的诊治和预防提供有效的技术手段。

附图说明

图1是本发明试剂盒对华支睾吸虫DNA的PCR扩增结果图，

图中：M：100bpDNAmarker，1-2:目的扩增条带。

图2是本发明试剂盒的特异性试验结果图，

图中：M：100bpDNAmarker；1:目的扩增条带；2-4:简单异尖线虫、刺激隐核虫和棘颚口线虫。

图3是本发明试剂盒的敏感性试验结果图，

图中：M：100bpDNAMarker；1：40ng/μL华支睾吸虫DNA；2：4ng/μL华支睾吸虫DNA；3：400pg/μL华支睾吸虫DNA；4：40pg/μL华支睾吸虫DNA；5：4pg/μL华支睾吸虫DNA；6：0.4pg/μL华支睾吸虫DNA。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

本发明实施如下：

1、材料与方法

1.1材料：