[发明专利]一种芽孢杆菌及其高密度培养方法

说明书

本发明公开了一种芽孢杆菌及其高密度培养方法，该菌株为芽孢杆菌(Bacillus sp.)13002，保藏编号为CGMCC No.7431。培养方法为：(1)将处于对数期生长的芽孢杆菌13002的菌悬液于种子培养基中，进行活化培养，得到种子培养液；(2)将种子培养液接种于发酵培养基中，进行发酵培养至16h～36h收集发酵培养液；(3)将发酵培养液离心后收集菌泥，用生理盐水清洗，加入菌种保护剂后，混合均匀后，进行干燥，得菌粉。本发明冻干后使其活菌总数达0.730×10¹¹CFU/g以上，较好地克服了培养过程中产酸抑制菌体生长的问题，可较大程度地提高芽孢杆菌13002的生长率。

技术领域

本发明涉及微生物发酵工程领域，具体是指一种芽孢杆菌13002及其高密度培养方法。

背景技术

凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)属能产生芽孢的、杆菌类乳酸菌。革兰氏阳性菌，代谢类型为兼性厌氧型，有氧条件较无氧条件能够产更多的生物量。菌体呈杆状，芽孢端生，无鞭毛。最适生长温度为40℃～50℃，最适生长pH值一般为6.6～7.0，发酵培养可产乳酸。同时，凝结芽孢杆菌是益生菌领域的潜力股，具备耐高温、耐胆盐、耐酸等抗逆性，对于部分抗生素和某些有害菌也有一定的抑制能力。近年来，凝结芽孢杆菌已然成为国内外研究的热点之一，研究的重点在于如何用低廉易获得的培养基获得高密度培养的凝结芽孢杆菌菌体。而国内对于凝结芽孢杆菌的研究才处于刚起步阶段。

对于微生物发酵培养来说，高密度培养技术(HCDC，high cell density culture)指的是模拟人体生长环境，使细胞在特定细胞生物反应器中快速增长，从而充分提高菌体的发酵密度和生物量，或增加特定代谢产物的比生长率的一种培养技术。从广义上讲，凡是微生物培养至密度较高，活菌数达10¹¹～10¹²CFU/g的均可成为高密度培养；实际上，由于菌种之间的特性差异，对于生长很慢的微生物，只要增长至较原来提高10倍甚至更高倍数的时候，便可以视作高密度培养。分批补料培养(fed-batch culture)指在培养的某些阶段，不定期地添加物料，使菌体及其代谢产物能够持续增长的培养技术；这是目前针对益生菌进行高密度培养最完善、最经常被使用的方式。

申请号为201110169109.4的中国发明申请公开了“发酵乳酸菌的高密度培养方法”，是采用促进发酵乳杆菌增殖的专用培养基，并通过添加碱性物质以中和菌体代谢产生的酸，并适当补糖，克服发酵过程中碳源短缺和产酸抑制菌体生长的问题。但是对培养条件的优化较少；采用的糖反馈法属闭环控制，较为单一。

申请号为201310742351.5的中国发明申请公开了“一种用于芽孢杆菌的高密度培养方法及培养基”，适用于地衣芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌的高密度培养，得到的发酵液中芽孢形成率可在90％以上，芽孢密度最低在120亿/毫升以上。但是没有说明是否适用于凝结芽孢杆菌，也没有指出芽孢杆菌经高密度培养后达到的具体活菌数。

申请号为201410516317.0的中国发明申请公开了“一种植物乳杆菌及其高密度培养方法”，是通过pH不再降低来判断是否到达发酵终点，同时指出该菌株具有良好的酸耐受性、胆盐耐受性及抑制常见肠道致病菌生长特性。但是没有采用分批补料培养法，仅靠自然发酵不足以使菌种高密度培养达到最优水平。

上述现有技术指出高密度培养的限制因素和解决方法，主要包括：底物、产物或代谢副产物的负反馈作用；培养条件包括培养温度、pH值、溶氧量等的抑制作用。具体办法包括添加中和剂控制pH，添加碳源减少底物抑制等等，但仍存在适用范围受限、优化条件不足、方法选择单一等缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种芽孢杆菌13002及其高密度培养方法。既符合该菌种的研究趋势，也为该菌种的深入研究及实际应用提供理论基础。

本发明的目的通过如下技术方案实现：