[发明专利]羰基还原酶基因的应用、含该基因的工程菌及其催化还原反应的方法

说明书

本发明公开了一种来源于解脂耶氏酵母的重组羰基还原酶其编码基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌以及该重组酶或重组工程菌作为催化剂在不对称还原羰基化合物以制备光学活性手性醇中的应用。以重组酶作为催化剂可以不对称还原多种羰基化合物以制备光学活性手性醇，其催化效率高、立体选择性强。以重组工程菌作为催化剂不对称还原4‑氯乙酰乙酸乙酯(COBE)以高效制备(S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯，构建了底物耦联的反应体系。

技术领域

本发明属于生物催化不对称转化技术领域，涉及一种羰基还原酶及其基因，以及通过基因工程手段构建重组菌株，及其在不对称还原羰基化合物中的应用。

背景技术

光学活性手性醇是医药和精细化学品合成的重要中间体。例如，(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(Ethyl 4-chloro-3-hydroxybutanoate,(S)-CHBE)是一种重要的手性中间体，可用于很多活性药物的合成，如他汀类药物——羟甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂和4-羟基吡啶烷酮(4-hydroxypyrrolidone)等。

目前，光学活性手性醇的制备方法主要包括化学催化的羰基不对称还原法、生物催化的羰基不对称还原法和生物催化的消旋醇手性拆分法。其中，化学催化羰基的不对称还原，通常需要铑、钌等昂贵的金属催化剂。这些催化剂回收困难、污染环境，且反应能耗高。生物催化的手性拆分不需添加辅酶，但该方法的缺点在于目标构型的产物最高收率不会超过50％。生物催化方法不仅反应条件温和、对环境友好，具有高度的区域选择性和立体选择性，而且避免了产物中重金属残留，恰好弥补了化学方法的不足之处，因此近几年来生物催化的羰基不对称还原反应在手性醇不对称合成中的应用越来越受到重视。

羰基还原酶是普遍存在于自然界中的一类氧化还原酶，能使羰基化合物不对称还原生成手性醇。随着基因组学、蛋白质组学和生物信息学的迅速发展，利用基因挖掘技术克隆新型羰基还原酶已成为一种重要手段。筛选具有较宽底物谱的新型羰基还原酶，研究其可以高效选择性催化的手性药物中间体，不仅可以拓宽其应用范围，提升其应用潜力，也为实现工业化生产奠定基础。解脂耶氏酵母可催化制备(R)-苯乙醇，在此基础上，利用基因组探矿的方式从已测序的解脂耶氏酵母菌株中克隆一种新型的羰基还原酶基因，构建了重组大肠杆菌，并将该羰基还原酶应用于不对称还原羰基化合中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的资源，即新型的羰基还原酶基因。

进一步的，包括提供了该羰基还原酶的氨基酸序列；表达该基因的载体；表达该羰基还原酶的重组工程菌；利用重组工程菌不对称还原羰基化合物制备手性醇的方法或者应用；以及利用该重组工程菌制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法。

具体的，本发明的技术方案包括：

一种羰基还原酶，其核苷酸序列如SEQ ID：1所示。

该多核苷酸序列来自于解脂耶氏酵母，具体的制备方法为：根据Genebank中收录的预测为氧化还原酶的解脂耶氏酵母基因(Genebank登录号：XM_500963.1)序列设计合成引物；然后以的基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增，获得完整的氧化还原酶全长基因序列。上述羰基还原酶YlCR2基因含有837bp碱基，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

所述的多核苷酸编码的酶在羰基还原中的应用。其中，所述酶的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。多核苷酸序列无内含子，其编码的蛋白质包含278个氨基酸，其在Genebank中的登录号为XP_500963.1，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

含有上述的多核苷酸序列的重组载体以及将重组载体转化得到的基因工程菌。