[发明专利]一种蚯蚓中蚓激酶的纯化方法

说明书

本发明公开了一种蚯蚓中蚓激酶的纯化方法，该方法采用阳离子交换层析法和凝胶过滤层析法从蚯蚓的匀浆液中分离纯化一种具有纤溶活性的纤溶酶,离子交换层析过程中采用CM Sephadex C‑5作为填料，PBS作为配基，NaCl作为洗脱液。该组分经过SDS‑PAGE检测为混合成分。实验结果表明它具有较高的纤溶蛋白酶活性。此方法简洁方便，成本低，适用于规模化生产。

技术领域

本发明涉及一种分离纯化蚯蚓提取物(蚓激酶)的方法，特别是涉及CM SephadexC-50阳离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析对蚯蚓提取物进行蛋白分离纯化，且蛋白组分具有较高的纤溶蛋白酶活性的方法。

背景技术

蚯蚓在中医上又称地龙，我国传统的中医药学中，蚯蚓作为中药具有解热、定惊、利尿、降压等功效。蚯蚓体内的蛋白质含量非常丰富，且具有人体所需的10种氨基酸，其含量和营养价值都很高，甚至超过大豆蛋白。而且其体内的不饱和脂肪酸含量高，尤其是亚油酸，其具有抗癌、降血压，防止动脉硬化的作用。此外维生素和微量元素含量也很丰富，蚯蚓的药用价值已成为人们研究蚯蚓的热点。

目前研究的最多的是蚯蚓体内的酶，包括其中的血纤蛋白溶酶(也叫纤溶酶)、胶原蛋白酶等，还有蚯蚓超氧化物歧化酶、蚯蚓过氧化氢酶，蚯蚓金属硫蛋白酶等。

1982年Mihara自Lumbrwus rubeHus中提取出一组具有纤溶活性的纤溶酶，命名为蚓激酶(1umbrmonase)。由于蚓激酶具有治疗心脑血管疾病的性质，而使其成为研究的热点。蚓激酶具有直接溶解纤维蛋白和激活纤溶酶原间接溶解纤维蛋白的双重作用。在临床上，该酶可口服后经肠胃进入血液，同时可降低血液粘滞度、改善微循环。对缺血性心脑血管病、陈旧性血栓病、高血压、动脉硬化、心肌梗塞等具有较好治疗作用，尤其对因脑血管病导致的肢体瘫痪及语言障碍的恢复效果显著。其特点是稳定性好、纤溶活性强、药理作用广泛、口服有效、副作用小，许多国内外科研人员都在致力于这类新的溶栓酶类新药开发。此后，人们从不同的蚯蚓品种中获得该酶，且对其研究也同益深入。

发明内容

本发明的目的是提供一种采用CM Sephadex C-50阳离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析对蚯蚓提取物进行蛋白分离纯化，且蛋白组分具有较高的纤溶蛋白酶活性的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种蚯蚓中蚓激酶的纯化方法，该方法包括如下步骤：

第一步，蚯蚓组织匀浆制备：吐净泥沙后的蚯蚓采用组织匀浆机分别制备得到含有蚯蚓体腔液的混合液和剩余皮渣；将含有蚯蚓体腔液的混合液高速离心分别得到蚯蚓体腔液和体腔液中的沉淀部分；所述剩余皮渣和所述体腔液中的沉淀部分进行细胞粉碎，粉碎后的产物和所述的蚯蚓体腔液再次混合和离心，离心取上清液。

在一些技术方案中，第一步中所述的蚯蚓为大平2号。

第二步，硫酸铵沉淀法纯化蛋白组分：在所述的上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，加入完毕后搅拌8～15h，搅拌后离心，取沉淀。

在一些的技术方案中，第二步中在加入饱和硫酸铵之前先加入EDTA-Na₂溶液，以减少硫酸铵溶液中残留的重金属离子造成蛋白质变性的可能性。在一些优选的技术方案中，搅拌是在温度为0℃的条件下搅拌12h，离心的条件是以转速为10000r/min离心15min。

在一些优选的技术方案中，第二步中上清液与饱和酸铵溶液的体积为1～3：1。

第三步，透析去盐：在第二步中的沉淀中加入PBS缓冲液并摇匀至无沉淀，得到混合液；将该混合液灌入透析袋，并将透析袋置于PBS缓冲液中，对透析后产物进行离心，离心后取上清液即为蚯蚓蛋白粗提物。

在一些技术方案中，第三步中的离心是以转速为10000r/min离心15min。