[发明专利]一种细胞源性质控品的制备方法

权利要求书

1.一种细胞源性质控品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)、细胞的准备

1)细胞的复苏：从液氮罐中取出对应细胞冻存管，放入备好的42℃温水中快速摇动，直至管中的液体恢复常温；于超净台中将冻存管用质量百分含量75％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加5mL培养液，在1500r/min速度下离心5分钟，弃去上层液，加入培养液后接种于培养皿中，置37℃温箱静置培养；

2)细胞传代培养：于超净台中取复苏的培养细胞，吸去培养皿中的培养液，沿皿壁加入2mL的1×PBS清洗细胞，吸去PBS，再用PBS清洗一次；

向培养皿中加入0.5mL的质量百分含量为0.25％胰酶，摇晃培养皿使胰酶与皿底细胞充分接触消化，1min后吸去胰酶，于显微镜下观察细胞状态，至细胞基本恢复圆滑状态；

向培养皿中加入3mL培养液，用移液器将皿底细胞来回吹打混匀，显微镜下观察细胞浓度，视细胞浓度向另一培养皿中加入600～1500μl的细胞悬浮液，并加入3mL培养液，用移液器轻轻吹打混匀，显微镜下观察细胞密度；

置37℃温箱静置培养，观察生长情况；

3)细胞的收集：贴壁生长于培养皿中的细胞，用胰酶消化完全后直接回收到离心管中，收集完毕的细胞放在0℃冰箱保存；

(2)、细胞的石蜡包埋

1)细胞收集：将培养出的已经计数好的细胞收集于离心管中，1500r/min离心5分钟，弃上清；

2)细胞固定：向离心管中加入质量百分含量10％的中性福尔马林，摇匀后斜放在4度冰箱中固定60分钟，然后1500r/min离心5分钟，弃上清；加入适量PBS清洗一次，1500r/min离心5分钟，弃上清，保留少许PBS以用作混匀细胞；

3)细胞脱水：按照乙醇浓度从低到高的梯度进行，每步脱水完成时1500r/min离心5分钟，弃上清：50％乙醇30分钟；

70％乙醇30分钟；85％乙醇30分钟；95％乙醇30分钟；100％乙醇20分钟；100％乙醇20分钟；

4)石蜡包埋：在62℃环境下于通风橱中进行操作，具体操作如下：1/2体积的二甲苯加1/2体积的石蜡30分钟，吸去二甲苯及石蜡；完全石蜡1小时，对细胞进行初步包埋，待石蜡冷却后对包埋的细胞块进行修剪，得到含有细胞的石蜡包埋块；然后进行二次包埋，用石蜡包埋1小时，降温，待石蜡凝固即可。

2.如权利要求1所述的细胞源性质控品的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中2)细胞传代培养和3)细胞的收集之间还包括细胞的冻存，具体步骤如下：

配制冻存液：按如下体积比例DMEM:FBS:DMSO＝7:2:1来配制冻存液，将细胞培养液、PBS、胰蛋白酶和冻存液温浴到37℃；

冻存时的细胞要生长状态好、生长旺的细胞，用细胞传代方法消化细胞，用适量细胞培养液终止消化，重悬细胞；室温200g离心10分钟收集细胞，用冻存液重悬细胞，并调节浓度至约1×10⁶个细胞，4℃30min，转到-20℃30min，再在-80℃过夜；将细胞转入液氮中。

3.如权利要求1所述的细胞源性质控品的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中3)细胞脱水和4)石蜡包埋之间还包括：细胞透明，具体过程如下：用二甲苯逐步替代掉无水乙醇，在通风橱中进行，具体操作如下：先以1/2体积的无水乙醇加1/2体积的二甲苯20分钟，吸去上清；再1/3体积无水乙醇加2/3体积二甲苯20分钟，吸去上清；然后换成二甲苯20分钟，吸去二甲苯后即可进行细胞的石蜡包埋步骤。

4.如权利要求1所述的细胞源质控品的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的3)细胞的收集，具体为：贴壁生长于培养皿中的细胞，在用胰酶消化完全后可加入PBS，然后直接回收到离心管中。