[发明专利]一种细胞源性质控品的制备方法在审
申请号: | 201510514774.0 | 申请日: | 2015-08-20 |
公开(公告)号: | CN105177124A | 公开(公告)日: | 2015-12-23 |
发明(设计)人: | 刘昌军;刘沛;朱柳;丁朋举;李江浩 | 申请(专利权)人: | 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 |
主分类号: | C12Q1/68 | 分类号: | C12Q1/68 |
代理公司: | 北京同辉知识产权代理事务所(普通合伙) 11357 | 代理人: | 刘洪勋;郭丽英 |
地址: | 100176 北京市大兴区经济技*** | 国省代码: | 北京;11 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 细胞 性质 制备 方法 | ||
1.一种细胞源性质控品的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)、细胞的准备
1)细胞的复苏:从液氮罐中取出对应细胞冻存管,放入备好的42℃温水中快速摇动,直至管中的液体恢复常温;于超净台中将冻存管用质量百分含量75%酒精擦拭消毒后,打开盖子,用吸管将细胞悬液注入离心管中,再滴加5mL培养液,在1500r/min速度下离心5分钟,弃去上层液,加入培养液后接种于培养皿中,置37℃温箱静置培养;
2)细胞传代培养:于超净台中取复苏的培养细胞,吸去培养皿中的培养液,沿皿壁加入2mL的1×PBS清洗细胞,吸去PBS,再用PBS清洗一次;
向培养皿中加入0.5mL的质量百分含量为0.25%胰酶,摇晃培养皿使胰酶与皿底细胞充分接触消化,1min后吸去胰酶,于显微镜下观察细胞状态,至细胞基本恢复圆滑状态;
向培养皿中加入3mL培养液,用移液器将皿底细胞来回吹打混匀,显微镜下观察细胞浓度,视细胞浓度向另一培养皿中加入600~1500μl的细胞悬浮液,并加入3mL培养液,用移液器轻轻吹打混匀,显微镜下观察细胞密度;
置37℃温箱静置培养,观察生长情况;
3)细胞的收集:贴壁生长于培养皿中的细胞,用胰酶消化完全后直接回收到离心管中,收集完毕的细胞放在0℃冰箱保存;
(2)、细胞的石蜡包埋
1)细胞收集:将培养出的已经计数好的细胞收集于离心管中,1500r/min离心5分钟,弃上清;
2)细胞固定:向离心管中加入质量百分含量10%的中性福尔马林,摇匀后斜放在4度冰箱中固定60分钟,然后1500r/min离心5分钟,弃上清;加入适量PBS清洗一次,1500r/min离心5分钟,弃上清,保留少许PBS以用作混匀细胞;
3)细胞脱水:按照乙醇浓度从低到高的梯度进行,每步脱水完成时1500r/min离心5分钟,弃上清:50%乙醇30分钟;
70%乙醇30分钟;85%乙醇30分钟;95%乙醇30分钟;100%乙醇20分钟;100%乙醇20分钟;
4)石蜡包埋:在62℃环境下于通风橱中进行操作,具体操作如下:1/2体积的二甲苯加1/2体积的石蜡30分钟,吸去二甲苯及石蜡;完全石蜡1小时,对细胞进行初步包埋,待石蜡冷却后对包埋的细胞块进行修剪,得到含有细胞的石蜡包埋块;然后进行二次包埋,用石蜡包埋1小时,降温,待石蜡凝固即可。
2.如权利要求1所述的细胞源性质控品的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中2)细胞传代培养和3)细胞的收集之间还包括细胞的冻存,具体步骤如下:
配制冻存液:按如下体积比例DMEM:FBS:DMSO=7:2:1来配制冻存液,将细胞培养液、PBS、胰蛋白酶和冻存液温浴到37℃;
冻存时的细胞要生长状态好、生长旺的细胞,用细胞传代方法消化细胞,用适量细胞培养液终止消化,重悬细胞;室温200g离心10分钟收集细胞,用冻存液重悬细胞,并调节浓度至约1×106个细胞,4℃30min,转到-20℃30min,再在-80℃过夜;将细胞转入液氮中。
3.如权利要求1所述的细胞源性质控品的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中3)细胞脱水和4)石蜡包埋之间还包括:细胞透明,具体过程如下:用二甲苯逐步替代掉无水乙醇,在通风橱中进行,具体操作如下:先以1/2体积的无水乙醇加1/2体积的二甲苯20分钟,吸去上清;再1/3体积无水乙醇加2/3体积二甲苯20分钟,吸去上清;然后换成二甲苯20分钟,吸去二甲苯后即可进行细胞的石蜡包埋步骤。
4.如权利要求1所述的细胞源质控品的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中的3)细胞的收集,具体为:贴壁生长于培养皿中的细胞,在用胰酶消化完全后可加入PBS,然后直接回收到离心管中。
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