[发明专利]一种空肠弯曲菌纳米PCR检测试剂盒及其检验方法

说明书

技术领域

本发明涉及空肠弯曲菌的检测技术领域。

背景技术

空肠弯曲菌（Campylobacterjejuni）属微需氧革兰氏阴性螺旋菌，是一种重要的人兽共患病病原体。各种动物（特别是牛、羊、鸡）都能感染，除可引起腹泻外，还可造成牛、羊和犬的流产、不孕、乳房炎和禽类的传染性肝炎等疾病。人类主要通过饮用被污染的水源及食用肉、蛋、奶等动物性食品而感染，可引起人腹泻和食物中毒，世界卫生组织已将该病列为常见的食源性传染病之一。

建立空肠弯曲菌快速、特异的检测方法是有效控制和预防该病的关键。空肠弯曲菌的检测方法主要包括传统的病原分离、生化试验，聚合酶链式反应（PCR）等，这些方法在病原检测中发挥了重要作用。但空肠弯曲菌培养条件苛刻，容易进入“活的非可培养”状态，使得常规的分离培养和生化鉴定耗时费力，不利于疫情爆发时快速诊断。PCR检测方法由于操作简单，灵敏性高、重复性好等优点被广泛应用，但在实际应用中，PCR技术存在诸多局限性，例如对复杂体系的扩增会出现非特异性产物扩增以及扩增效率不够高等问题。为解决以上问题，寻找可以提高PCR特异性和效率的添加剂显得极其重要。

纳米PCR技术是一种新型的PCR技术，其原理是把粒径为1nm～100nm的固相纳米金属颗粒悬浮在液体中形成纳米流体。由于纳米材料具有良好的热传导性，因此在添加了纳米金颗粒的PCR循环体系中，PCR反应会更快地达到目标温度，减少了在非目标温度的停留时间，进而缩短整个体系达到温度平衡所用的时间，减少非特性扩增，提高特异性扩增产量。因此，目前亟需建立一种能够快速、特异的检测空肠弯曲菌的纳米PCR检测手段。

发明内容

本发明针对上述现有技术的不足，提供了一种用于空肠弯曲菌检测的纳米PCR试剂盒及其应用，该试剂盒能够快速、特异的检测空肠弯曲菌。

本发明所采取的技术方案是：一种用于空肠弯曲菌检测的纳米PCR试剂盒，包括2×NanoPCRMix、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为SEQIDNo.1所示，所述下游引物的序列为SEQIDNo.2所示。

引物是根据GenBank公布的空肠弯曲菌序列，在其16SrRNA基因保守序列区域设计的一对特异性引物。

优选的，2×NanoPCRMix由DNA聚合酶、2×NanoPCRbuffer和dNTPMixture组成。

优选的，所述试剂盒还包括阳性对照。

其中，阳性对照可为将空肠弯曲菌接种LB培养基后，收集24～48小时细菌培养物。

本发明还提出了所述的试剂盒在制备检测待测样品中是否含有空肠弯曲菌的产品中的应用。

应用所述试剂盒检测待测样品中是否含有空肠弯曲菌的方法，包括如下步骤：

1、细菌DNA的提取

（1）取300μL组织研磨产物、粪便或增菌培养液置于1.5mL离心管中，加入蛋白酶K10μL，细胞裂解液300μL，50℃孵育2h后加入600μLtris-平衡酚，充分震荡5min，12000r/min离心10min；（2）将上清转移至新1.5mL离心管中加等体积酚：氯仿：异戊醇（1：24：25），充分混匀12000r/min离心10min；取上清，加酚：氯仿：异戊醇重复抽提一次；(3)抽提后将上清转移至新1.5mL离心管中，加入2倍体积冰浴后无水乙醇，1/10体积3mol/L醋酸钠，-20℃沉淀45min后12000r/min离心10min，弃上清，真空干燥箱干燥5min，用20μL无菌蒸馏水溶解沉淀，-20℃贮存备用。

待测样品可为粪便、肉、蛋、奶等。其中，待测样品预处理的方法为：将待测样品剪碎后，按照1:5的质量体积比加入生理盐水并研磨均匀，之后再进行DNA的提取。若待测样品为粪便，过滤除去内容物取滤液可直接提取DNA。

2、纳米PCR反应

在反应管中加入10μL2×NanoPCRMix、1μL上述DNA溶液、0.5μL10μM的上游引物（SEQIDNo.1）、0.5μL10μM的下游引物（SEQIDNo.2），最后加入无核酸酶水至总体积为20μL。

混匀后按如下反应程序进行：94℃3min，1个循环；94℃10s,55℃30s，72℃15s，共30个循环；72℃5min1个循环。反应结束后，经1%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物，若出现254bp大小的条带则待测样品含有空肠弯曲菌。