[发明专利]两株纤维堆囊菌的转化方法

说明书

本发明公开了两株纤维堆囊菌的转化方法。鉴于目前纤维堆囊菌的转化方法和可用质粒载体相对较少，因此本发明选用带双抗性的穿梭质粒载体和广宿主载体分别将外源基因(vgb)导入至两株纤维堆囊菌中，为建立纤维堆囊菌的遗传操作体系并促进纤维堆囊菌的基因工程改造奠定基础，从而提高纤维堆囊菌中活性次级代谢产物的丰度和产量。

本分案申请为申请号：201410049382.7，发明名称：两株纤维堆囊菌的转化方法，申请日：2014年02月12日的专利申请的分案申请。

技术领域：

本发明属于基因工程领域，具体涉及两株纤维堆囊菌的转化方法。

背景技术：

纤维堆囊菌是一种能降解利用纤维素的粘细菌，由于纤维堆囊菌能产丰富的活性代谢产物而受到广泛关注，据报道，纤维堆囊菌活性次级代谢产物占粘细菌中发现总量的48.4％。如纤维堆囊菌生产的埃博霉素具有很强的抗肿瘤活性。因此，通过建立适当的遗传操作体系，利用基因工程手段提高其次级代谢产物产量具有十分重要的意义，但由于纤维堆囊菌极易成团，生长缓慢，而且缺乏适合的遗传操作载体，因此对于纤维堆囊菌的遗传操作改造进展较为缓慢。夏志洁等(Xia Z-J,Wang J,Hu W,Liu H,Gao X-Z,Wu Z-H,Zhang P-Y,Li Y-Z.Improving conjugation efficacy of Sorangium cellulosum by theaddition of dual selection antibiotics.Journal of industrial microbiology &biotechnology,2008,35(10):1157-1163)利用结合转移和自然转化等方法将外源基因转入纤维堆囊菌，但重组质粒构建及转换过程耗时较长，虽然1992年Jaoua等(Jaoua,S.,S.Neff,T.Schupp.Transfer of mobilizable plasmids to Sorangium cellulosum andevidence for the integration into the chromosome.Plasmid,1992,(28):157-165)建立了利用IncPCR质粒pME305介导PSJB55结合转移至菌株So ce 26中，但由于纤维堆囊菌的菌株特异性，该方法并不适用于其他菌株。因此完善纤维堆囊菌的转化方法，建立纤维堆囊菌的遗传操作体系对于促进纤维堆囊菌的基因工程改造以获得更多的活性次级代谢产物就显得十分必要。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种纤维堆囊菌So ce M1的转化方法，利用该方法可以成功的将外源基因转入纤维堆囊菌So ce M1中，为建立纤维堆囊菌的遗传操作体系并促进纤维堆囊菌的基因工程改造奠定基础，从而提高纤维堆囊菌中活性次级代谢产物的丰度和产量。

本发明的纤维堆囊菌So ce M1的转化方法，其特征在于，包括以下步骤：制备纤维堆囊菌So ce M1的原生质体，将外源基因与质粒PBEP43连接构建重组质粒PBEP43-外源基因，然后将重组质粒PBEP43-外源基因利用PEG介导转化至纤维堆囊菌So ce M1的原生质体中。

所述的外源基因为透明颤菌血红蛋白基因vgb。

具体步骤优选为：

a.原生质体的制备：以体积分数2.5％的接种量将纤维堆囊菌So ce M1接种至液体培养基，培养至对数生长期，离心得到菌体，用PBS溶液洗涤2次，再用体积分数14％甘露醇溶液充分悬浮So ceM1细胞，然后用质量分数15％EDTA溶液处理细胞30min，PBS洗涤，再用3mg/ml溶菌酶于30℃作用2h，用体积分数14％甘露醇溶液充分洗涤以去除残留酶液，得到纤维堆囊菌So ce M1的原生质体；