[发明专利]视网膜色素上皮细胞上皮－间充质转换模型及其应用

说明书

本发明涉及一种视网膜色素上皮细胞上皮－间充质转换模型及其应用。将ARPE‑19细胞用胰酶消化后，再转入无血清含N2和非必需氨基酸的DMEM‑F12培养基中，并在陪替氏培养皿中培养，即得视网膜色素上皮细胞上皮－间充质转换模型；该模型用于研究视网膜色素上皮细胞发生上皮－间充质转换的分子机制及寻找上皮－间充质转换的干预靶向。与现有技术相比，本发明方法简单易行、重复性好。

技术领域

本发明涉及一种细胞模型，尤其是涉及一种视网膜色素上皮细胞上皮－间充质转换模型及其应用。

背景技术

增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是导致孔源性视网膜脱离手术失败的最主要的原因，因其难治性与复发性一直是各国学者研究的热点，PVR的发生率是5％-20％。PVR属于增生性疾病。PVR的基本病理过程是视网膜出现裂孔之后，血—视网膜屏障破坏，玻璃体中蛋白质和活性介质(如transforming growth factor(TGF)-β,and fibroblast growth factor(FGF))释放，视网膜色素上皮细胞(retinalpigment epithelial，RPE)暴露，与光感受器接触丧失，RPE游离、移行，细胞因子刺激RPE增殖，细胞表型发生改变，分泌多种炎性因子如白细胞介素-1、-2(IL-1，IL-2)，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)，肿瘤坏死因子(TNF)等，趋化胶质细胞、成纤维细胞和巨噬细胞等浸润，这些细胞通过旁分泌和自分泌大量细胞因子，如肝细胞生长因子(hepatocyte grownfactor,HGF)、血小板源性生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)、转化生长因子(transfer growth factor.TGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)等，然后联合胶原等细胞外基质(extracellular matrix，ECM)、纤维连接蛋白共同刺激RPE细胞、成纤维细胞等发生分裂、增殖，最后在视网膜表面或玻璃体内形成增生膜，RPE正是增生膜的主要细胞成分。最终由于增生膜的收缩导致牵拉性视网膜脱离，诱发PVR证实。

目前已发现的与PVR相关的细胞有5种：RPE、Muller细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和神经胶质细胞。在PVR的早期，发挥主要作用的是RPE细胞和成纤维细胞，在后期，发挥作用的细胞发生了改变，由成纤维细胞发挥主要作用，偶尔可见RPE细胞，mvller和胶质细胞则是在后期负责牵拉视网膜脱离的感受器细胞。因其基本病理过程归因于RPE细胞发生了上皮-间充质细胞转换(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的转变，进而移行、增生而形成增生膜，并成为增生膜的主要细胞成分，所以RPE是PVR形成过程中最重要的细胞。

Dunn证实RPE细胞(ARPE-19)具有活体内RPE细胞所特有的结构和功能特点。因此，可用于体外实验。

EMT转化的机制多种多样的，但是它们都有两个共同的特征，一是通过各种信号通路使细胞间的连接减弱，二是使上皮细胞表型发生转变，获得间质细胞表型，通常转为成纤维细胞和肌成纤维细胞。在EMT的过程中，上皮细胞失去了它的极性和细胞间的连接，失去了它的相关的表型而获得了间质细胞和类似间质细胞的可以移动和侵入的能力，导致细胞本身周围的细胞相脱离、迁移，远离原来的位置，而不再是连接紧密的不可移动的上皮细胞。目前已有研究表明，在诱导人类RPE细胞EMT的过程中会导致一些基因(如TGF-β1、n-cadherin等)的表达的上调，抑制这些基因的表达也会使EMT的发展受到限制，在有PVR的患者的视网膜前膜可以检测到这些基因的表达。

根据已有的文献报道，在RPE发生EMT过程有5条信号通路被激活：玻璃体内容物介导的TGF-β1通路、Wnt通路、STAT通路、MAPK通路、Notch通路。如果对RPE发生EMT早期事件进行干预，早期激活的信号通路进行阻滞，将对预防治疗PVR提供了新的策略。