[发明专利]无血清培养基及干细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程技术领域，特别涉及无血清培养基及干细胞的培养方法。

背景技术

目前，在干细胞的常规培养体系中均加入了一定比例的动物血清，比较常用的是胎牛血清或新生小牛血清。血清是由很多大小不同生物分子组成的极为复杂的混合物，它对细胞在体外培养时的主要作用是提供生长因子、激素、结合蛋白，并提供保护作用。但它也含有一些不利于细胞生长的抑制因子或毒性物质，具有潜在的细胞毒性作用。血清中大量成分复杂的蛋白质，给细胞培养的标准化带来困难，同时也给细胞培养表达产品分离纯化带来很大的困难。而且动物血清可能存在动物携带的已知或未知病原体，对以后可能的临床应用构成威胁，对用于规模化培养干细胞增加了难度。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中利用动物血清培养细胞存在一定的毒性作用及病原体污染等缺陷，提供一种无毒性且无污染的无血清培养基。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种无血清培养基，包括基础培养基，还包括胰岛素、含铁的食品添加剂、亚硒酸钠、纤粘连蛋白、胰高血糖素、肝细胞生长因子和青链霉素。

在本发明提供的无血清培养基中，所述含铁的食品添加剂包括转铁蛋白、柠檬酸铁、二甲胂酸铁和葡糖酸铁中的一种或多种。

在本发明提供的无血清培养基中，所述无血清培养基中，亚硒酸钠的浓度为5-20μg/ml、含铁的食品添加剂的浓度为2-10μg/ml、胰岛素的浓度为2-10μg/ml、纤粘连蛋白或层粘连蛋白的浓度为0.1-2μg/ml、胰高血糖素的浓度为1-10μg/ml、肝细胞生长因子的浓度为10-30ng/ml，以及青链霉素的浓度为20-200U/ml。

在本发明提供的无血清培养基中，还包括表皮生长因子和HEPES。

在本发明提供的无血清培养基中，所述表皮生长因子的浓度为10-30ng/ml和HEPES的浓度为5-20mmol/l。

在本发明提供的无血清培养基中，还包括氢化可的松、地塞米松和雌激素三者中的一种。

在本发明提供的无血清培养基中，所述氢化可的松的浓度为6-10nmol/l，或，地塞米松的浓度为0.1-2nmol/ml，或，雌激素的浓度为1-10nmol/l。

在本发明提供的无血清培养基中，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。

本发明进一步提供一种干细胞的培养方法，包括如下步骤：

获取干细胞，采用上述的无血清培养基进行体外培养。

实施本发明提供的无血清培养基及干细胞的培养方法，可以达到以下有益效果：1、采用无血清培养基能够避免现有技术存在血清批次间的质量差异，提高细胞培养和试验结果的重复性；2、可避免现有技术存在的血清所带来的外源性污染及血清组分的细胞毒性作用；3、能够避免不明的血清组分对细胞培养及试验研究的影响；4、成份相对明确、质量一致且蛋白含量低，有利于提高细胞产品生产的稳定性并使细胞产品易于纯化；5、能够延长细胞的GI期或迫使细胞处于G0期而较长时间的维持细胞高密度培养，从而尽可能的生产目的产物，并更好地保持干细胞的特性。

具体实施方式

为解决现有技术中采用含有动物血清的培养基培养干细胞血清组分存在易产生毒性作用，并携带有病原体且细胞分离纯化困难等缺陷，本发明的创新点在于提供一种无血清培养基，通过在培养基中加入能够替代血清的补充因子，从而实现了无污染培养干细胞，提高细胞产品生产稳定性的目的。

本发明提供的一种无血清培养基，包括基础培养基、胰岛素、含铁的食品添加剂、亚硒酸钠、纤粘连蛋白、胰高血糖素、肝细胞生长因子和青链霉素。

其中，基础培养基中的葡萄糖是细胞生长增殖以及产物表达过程中的重要能量来源，优选地，基础培养基为DMEM/F12培养基，该DMEM/F12培养基中含有极其丰富和复杂的细胞生长所需的营养物质，能够支持多种类型细胞在无血清的培养基中生长。

胰岛素能够促进细胞利用葡萄糖和蛋白质，促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡，是非常重要的细胞存活因子；优选地，无血清培养基中，胰岛素的浓度为2-10μg/ml。