[发明专利]ermC基因在检测土壤抗生素抗性污染水平中的应用与方法

权利要求书

1.一种ermC基因在检测土壤抗生素抗性污染水平中的方法，其特征是：具体包括以下的步骤：

（1）选用正向引物序列如SEQ ID No.1和反向引物序列如SEQ ID No.2，对目的抗性基因ermC进行PCR扩增；

（2）切胶回收纯化扩增后的目的抗性基因，将抗性基因连接在T载体上，然后转化感受态大肠杆菌细胞，涂LB/氨苄/IPTG/X-Gal平板后挑选阳性克隆子，用含有氨苄的LB培养液进行培养；

（3）检测从含有氨苄的LB培养菌液中提取的质粒的浓度，换算出单位体积质粒所携带抗性基因的拷贝数，将含有目的基因的质粒按10倍梯度进行系列稀释，作为抗性基因标准品；

（4）提取土壤DNA，土壤DNA和抗性基因标准品同时进行定量PCR扩增ermC基因，根据ermC基因的富集倍数和公式y=734.623+2.606x，其中x为ermC富集倍数，y为ARGs总富集倍数，进而得出土壤抗生素抗性污染水平。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是：ermC基因的长度是84bp。

3.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述步骤（1）中的PCR扩增反应体系为25μL，其中包括2μL的模板DNA为1-10ng，各0.5μL的正、反向引物，浓度为10μM，12.5μL的2× PremixEx TaqTM和9.5μL的无菌双蒸水；

PCR扩增条件为：95℃预变性10min；40个循环的95℃保持20s，60℃保持20s和72℃保持30s；72℃保持5min。

4.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述步骤（2）中的转化感受态大肠杆菌细胞具体步骤为：从-80℃冰箱取出感受态细胞，冰上解冻5min，轻敲混匀后转移40μL感受态细胞至连接反应管，轻击离心管混匀并于冰上放置20min，之后在42℃水浴45-50s，然后迅速转移至冰上放置2min，加入950μL的SOC培养液至连接反应管，在37℃，150转/分振荡培养1.5小时，然后将每个转化培养基100μL涂到两个LB/氨苄/IPTG/X-Gal 平板上，将平板于37℃过夜培养，取出平板后放4℃显色10h，挑选白斑菌落。

5.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述步骤（3）中，质粒浓度换算成每μL质粒溶液中目的基因的拷贝数的公式为：质粒浓度（ng/μL）×6.02×1023/[(插入片段长度+3015)×660×109]。