[发明专利]一种饮水感染结核分枝杆菌豚鼠模型的建立方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种动物模型建立方法，特别涉及一种饮水感染结核分枝杆菌豚鼠模型的建立方法。属于医学生物学技术领域。

背景技术

结核病（TB）是由结核分枝杆菌（Mtb）引起的慢性消耗性传染病，位居单一病原体引起死亡的严重传染病之首。据世界卫生组织(WHO)估计，近1/3的世界人口被Mtb感染，每年约有880万新增TB病例，140万人死于TB。中国是仅次于印度的全球第二大TB高负担国家，因此，研发预防和治疗Mtb感染的疫苗和药物已成为当今TB研究领域的重大课题。而评估抗TB疫苗和药物则有赖于合适的动物模型，豚鼠对Mtb高度易感，迟发型超敏反应较为剧烈，已被广泛应用于抗TB药物和疫苗等生物制剂的研究开发与效果评价中，其为人类结核菌素皮试(OT)效能和相关生物制品鉴定效价的金标准。此外，根据《中国药典》2010 版第三部，体内诊断类TB生物制剂必须使用致敏豚鼠进行效果评价。豚鼠与人类有很多相似之处: (1)和人新生儿类似，初生豚鼠具有成熟的淋巴髓细胞样复合体; (2)和啮齿动物相比，豚鼠激素水平及其免疫功能更接近于人; (3)和人类一样，豚鼠需要外源性补给维生素C; (4)和灵长类动物包括人相似，豚鼠具有糖皮质激素抵抗性; (5)豚鼠呼吸道生理与人非常接近，特别是肺部对炎症刺激的反应。而且，豚鼠感染Mtb后会造成肺脏严重组织损伤，导致广泛的干酪化和组织坏死，病变部位出现钙化或空洞，临床表现为呼吸微弱、体重骤减，感染8-20周后死亡，这一发病过程与人体感染Mtb相似，因此豚鼠可比较好地模拟人体感染Mtb的病变过程。目前豚鼠TB动物模型常用的攻毒方法有皮下注射和经呼吸道攻毒；皮下注射攻毒需要使用注射器，攻毒时对实验人员有潜在危险；经呼吸道攻毒需要使用特殊装置，如气溶胶发生器。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的是为建立更安全、简便、可靠的TB动物模型，探索通过饮水感染Mtb构建豚鼠疾病模型。

本发明通过以下技术方案实现，一种饮水感染结核分枝杆菌豚鼠模型的建立方法，经过下列步骤：

1）实验动物准备：选用健康豚鼠，实验前严格检疫，排除Mtb潜伏感染；

2）感染用Mtb菌株制备: 取Mtb H37rv菌株接种于新鲜改良罗氏斜面培养基上，37 ℃培养3周;取培养基上生长的Mtb菌落，无菌操作刮下并准确称重后，置于无菌研钵内研磨成混浊菌悬液，然后将菌液分装到1.5 mL无菌冻存管，置入-80 ℃保存。使用平皿培养法(7H10培养基）确定储存菌种的菌落形成单位（CFU）；从- 80 ℃冰箱取出菌种，置37 ℃水浴箱内溶解，将菌液用生理盐水按实验需要稀释配制成不同浓度的菌液。稀释好的菌液再接种于7H10平皿上，37 ℃培养3-5周，确定实际细菌的数量；

3）豚鼠饮水感染结核分枝杆菌：在生物安全三级实验室选用豚鼠，攻毒前豚鼠禁水8h，结核分枝杆菌菌液室温融化后混入400mL饮用水中至攻毒浓度2×10³-2×10⁸ CFU/mL，每个笼子放1只豚鼠和1个400mL饮用水瓶，豚鼠1天内会将400mL含有结核分枝杆菌的水饮用完，待含结核分枝杆菌饮用水被豚鼠喝完后，更换新的饮水瓶，动物供应正常饮用水和食物。

优选的实验动物豚鼠的体重体重规格300-350g。

优选的结核分枝杆菌攻毒浓度为2×10⁵ CFU/mL。

本发明的有益效果是：①操作更简便，对试验技术要求不高，攻毒过程中不使用针具，对操作人员来说也更安全；此外，本发明不需要特殊装置，而经呼吸道攻毒需要应用气溶胶发生器；②本模型具有较好的可控性、可靠性、可重复性且使用方便、经济；②本模型TB病变特征符合临床发病过程；③造模因素符合《传染病学》理论；④本模型攻毒方式更为自然，对豚鼠应激刺激也小，有利于获得更真实、可靠的试验数据。

附图说明

图1为豚鼠饮水感染Mtb 4周后旧结核菌素皮试结果示意图。

左侧标记处为生理盐水对照，右侧旧结核菌素皮试部分出现明显红、肿、破溃等阳性反应。

图2为豚鼠饮水感染Mtb 4月后肺脏病理变化示意图。

肺泡间隔明显增宽，结缔组织增生形成结节状肉芽肿，其内可见较多上皮样细胞，成纤维细胞和淋巴细胞。

图3为豚鼠饮水感染Mtb 4月后脾脏病理变化示意图。

白髓及脾索内纤维组织增生形成结节样肉芽肿，并包裹坏死物形成钙化灶。