[发明专利]一种胰岛β细胞内胰岛素原正确折叠率的检测方法

权利要求书

1.一种胰岛β细胞内胰岛素原正确折叠率的检测方法，具体包括以下步骤：

a、胰岛β细胞的培养：

取复苏冻存细胞，用含10%(v/v)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEM高糖培养基，在37℃、5%(v/v)CO₂的恒温培养箱中培养，每1~3天换液一次，常规传代；

b、胰岛β细胞的处理：

待步骤a后MIN6分为4组继续培养，分组后细胞贴壁良好、密度适中时，分别换成含环孢素A的DMEM高糖培养基，药物浓度分别为0μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L，干预MIN6细胞48小时；

c、胰岛β细胞内蛋白的提取：

将步骤b处理后的细胞用细胞裂解液裂解，12000rpm离心30min后提取上清，得到胰岛β细胞胞浆蛋白，将提取的蛋白进行蛋白定量，把不同组蛋白溶液调整成同一浓度；

d、胰岛β细胞胞浆蛋白的还原性westernblotting实验：

取调整好浓度的蛋白溶液16ul，加入4ul5×还原性蛋白质电泳缓冲液，沸水中煮沸5min，进行SDS-PAGE蛋白质电泳，其中12%分离胶，5%浓缩胶，电泳后将胶中蛋白转移到5×8cm大小的PVDF膜，转膜完成后用含5%脱脂奶粉的PBST室温封闭2h，4℃过夜孵胰岛素一抗，孵完一抗用PBST洗膜3次，每次10min，室温2h孵鼠抗二抗，孵完二抗用PBST洗膜3次，每次10min，再用PBS洗膜一次，洗后曝光显影，得到胰岛素westernblotting结果；

e、胰岛β细胞胞浆蛋白的非还原性westernblotting实验：

取调整好浓度的蛋白溶液16ul，加入4ul5×非还原性蛋白质电泳缓冲液，不煮沸直接进行SDS-PAGE蛋白质电泳，电泳后将胶中蛋白转移到5×8cm大小的PVDF膜，转膜完成后用含5%脱脂奶粉的PBST室温封闭2h，4℃过夜孵C肽一抗，孵完一抗用PBST洗膜3次，每次10min，室温2h孵兔抗二抗，孵完二抗用PBST洗膜3次，每次10min，再用PBS洗膜一次，洗后曝光显影，得到胰岛素原westernblotting结果；

f、胰岛β细胞内胰岛素原正确折叠率的检测：

利用QuantityOne软件对westernblotting结果进行灰度分析，计算胰岛素原正确折叠率。