[发明专利]一种利用重组钝齿棒杆菌一步发酵法生产L-鸟氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及到精氨酸酶基因的克隆表达获得重组工程菌，同时将该工程菌应用于L-鸟氨酸的生产，属于生物工程和生物技术领域。

技术背景

鸟氨酸是一种碱性氨基酸，易溶于水和乙醇，微溶于乙醚等有机溶剂。鸟氨酸接受二分子NH₄⁺和一分子CO₂形成一分子L-精氨酸。L-精氨酸亦可以在精氨酸酶的作用下被水解成鸟氨酸和尿素。

L-鸟氨酸是一种重要的非蛋白质氨基酸，是精氨酸和脯氨酸合成的重要前体物质。同时L-鸟氨酸是人体内尿素循环的重要中间代谢产物，因此其对肝脏的解毒功能具有重要的保障作用。L-鸟氨酸能够刺激体内生长激素的分泌，促进蛋白质的合成以及糖类和脂质的分解代谢作用。L-鸟氨酸和其他氨基酸一起制成的复方氨基酸有很好的保肝护肝以及激发病态下肝脏的活力的作用。联合使用L-鸟氨酸和苯乙酸能有效治疗肝性脑病，特别是对于鸟氨酸循环障碍的患者，L-鸟氨酸能通过促进谷氨酰胺的合成和排泄来稳定的降低患者血氨浓度。鸟氨酸α-酮戊二酸盐是很好的临床营养剂，促进外科创伤病人的恢复，改善慢性营养不良，改善免疫功能。同时鸟氨酸和苹果酸盐和柠檬酸盐合用能够改善食品和饮料的口味，减少苦味。在欧洲、美国以及日本，L-鸟氨酸都是作为膳食药物来销售的。

工业上L-鸟氨酸的合成包括化学合成法、微生物发酵法和L-精氨酸水解法。化学合成作为早期L-鸟氨酸的生产方法，一般以丙烯醛、氰化氢、氨气、CO2为原料合成L-鸟氨酸。但效果并不是很理想，主要表现在于合成的步骤繁琐，产物得率低，而且得到的产物是L-鸟氨酸和D-鸟氨酸的混合物，为后期的分离纯化带来很大的困难。同时化学法合成L-鸟氨酸由于其环境的危害性，越来越不被现代工业所接受。生物合成法相对化学合成法具有生产成本较低，环境污染小等优点而受到重视。微生物发酵生产L-鸟氨酸主要是通过诱变或者基因工程的方法获得L-鸟氨酸高产菌株，以较为便宜的葡萄糖甚至是淀粉等最为初始原料合成L-鸟氨酸。在这方面日本起步较早，上世纪五六十年代就开始鸟氨酸生产的研究，主要以诱变筛选为主。1957年kinoshita等首先报道了利用谷氨酸棒状杆菌的瓜氨酸或精氨酸的突变株发酵生产鸟氨酸。此后，okumuraheShibuya等人在这方面也做了大量的工作总结出了具有精氨酸缺陷型及精氨酸氧肟酸盐抗性的谷氨酸棒杆菌以及具有精氨酸和瓜氨酸，以及霉酚酸抗性等标记的柠檬酸节杆菌突变株用于工业生产中。国内陈宁、刘树庆等人在1999年开始研究鸟氨酸的生产，并以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过硫酸二乙酯和紫外线诱变定向选育出一种鸟氨酸生产菌，并通过发酵优化使得鸟氨酸产量达到9.85g/L。近几年，随着代谢工程技术的兴起，通过代谢工程改造的方法，鸟氨酸的发酵生产取得一定的进展，其中，中山大学蒋玲艳等人以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过表达异源的谷氨酸脱氢酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶，增加代谢流中NADPH的含量，使得L-鸟氨酸产量得到提高，最终到14.8g/L，而后蒋又通过代谢进化和代谢工程的方法，最后得到鸟氨酸的产量为24.1g/L。通过发酵法进行鸟氨酸生产可以利用较简单的碳源，如葡萄糖等，成本非常低廉，适合于工业的发展。

CorynebacteriumcrenatumSDNN403是实验室通过多级诱变筛选得到的一株L-精氨酸高产菌株。在5-L发酵罐上，在96小时内能够利用葡萄糖获得35/L左右的L-精氨酸(专利号ZL03112896.3，本菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNO.0890)。L-精氨酸可以在精氨酸酶的作用下水解形成L-鸟氨酸和尿素。

本发明通过表达载体pXMJ19，实现了将来源于Baciluscereus的精氨酸酶基因argI成功在C.crenatumSDNN403中进行表达，并利用此基因工程菌进行发酵，以葡萄糖为底物，一步法生产L-鸟氨酸，实现了L-鸟氨酸的高效生产。

发明内容

本发明的主要研究内容：本发明利用分子技术成功构建了一株高效表达精氨酸酶基因argI的工程菌株C.crenatumSDNN403/pXMJ19-argI。酶活测定结果发现该重组工程菌具有较高的精氨酸酶活性。基于获得的基因工程菌，在5-L发酵罐内对该菌株利用葡萄糖为底物采用双阶段pH调控的方法进行L-鸟氨酸生产进行了探究，并且对发酵条件，包括诱导时间，MnSO₄添加量，双阶段pH调控的时机等进行了优化。在120g/L葡萄糖添加下，108h内获得L-鸟氨酸的积累量为27.9g/L。