[发明专利]一种军团菌快速检测与分型的引物及方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物分子检测领域，尤其涉及一种军团菌快速检测与分型的引物及方法。

背景技术

军团菌是一种胞内寄生的革兰阴性杆菌，在土壤和水系统中广泛存在。目前军团菌属有52种包括70多个血清型，并不断有新的菌种从环境中分离。近年来发现，约有一半的军团菌种与人类疾病有关，其中80%以上的军团菌感染是由嗜肺军团菌引起。军团菌通过空气以气溶胶的形式感染人，引起军团菌性肺炎，严重威胁人类的健康。因此，建立一种能检测军团菌和快速鉴别嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌的方法具有重要的临床意义。

目前对军团菌的检测鉴定方法主要有血清抗体检测、尿可溶性抗原检测、军团菌分离培养等。但是上述的检测方法存在检测时间长、阳性率低、培养基的配置复杂和价格昂贵的缺陷，不利于军团菌的快速检测。近年来，分子生物学的发展为微生物的分类鉴定工作提供了较简便和准确的方法。PCR 方法具有很高的特异性与敏感性，其主要是通过检测军团菌中的特异基因，以达到快速检测军团菌的目的。

中国专利申请201410607389.6公开了一种快速区分非嗜肺、嗜肺与嗜肺I型军团菌的三重PCR检测方法，所述检测方法主要是针对军团菌种属、嗜肺军团菌种和嗜肺军团菌I型的16SrRNA、danI和ORF9三个基因的引物，对dNTPs和引物浓度比例以及退火温度进行优化，建立快速区分非嗜肺、嗜肺与嗜肺I型军团菌的三重PCR方法，该检测方法可以对分离培养到的可疑军团菌菌株进行快速有效的判定。但是，该检测方法只对可疑军团菌菌株进行分型，而且是利用了三个基因靶点，检测范围较狭窄，特异性不强，不利于该检测方法的推广和应用。

中国专利CN101717815B公开了一种军团菌快速检测与分型方法，该方法是以基因组DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳分析，对检测出阳性PCR产物进行酶切反应，对酶切反应产物作琼脂糖凝胶电泳分析进行分子分型。该检测方法能够检测出军团菌，且能将其分子分型为嗜肺军团菌或非嗜肺军团菌。但是，该检测方法的军团菌分型需要进行多次琼脂糖凝胶电泳分析，操作比较繁琐，大大限制了该检测方法的应用。

发明内容

为解决现有技术中军团菌的检测方法存在检测范围窄、操作繁琐的缺陷，本发明提供一种军团菌快速检测与分型的引物及方法，以解决上述问题。

本发明提供一种军团菌快速检测与分型的引物，其包括军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16s rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物，所述军团菌属特异引物为：

GL261F：5’-GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’(SEQ ID NO.1)，

GL261R：5’-CGATCTCTACGCATTTCACCG-3’(SEQ ID NO.2)；

所述嗜肺军团菌16s rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物为：

LP-A⁶²⁸R ：5’-GTCAACCAGTATTATCTGACCGT-3’(SEQ ID NO.3)，

LP-C⁶²⁹F ：5’- CTGGGCTTAACCTGGGAC-3’(SEQ ID NO.4)。

进一步地，所述军团菌属特异引物与嗜肺军团菌16s rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物的浓度比为1-3：1-3，所述军团菌属特异引物与嗜肺军团菌16s rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物的浓度比优选为2：1。

进一步地，所述军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16s rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物的靶基因为16S rRNA基因。

另外，本发明还提供了一种军团菌快速检测与分型的方法，包括如下步骤：

S1应用细菌基因组DNA提取液提取待测标本中的细菌基因组DNA；

S2以细菌基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16s rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物进行PCR扩增；

S3将阳性对照和阴性对照进行PCR扩增；

S4将所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

进一步地，所述步骤S1中细菌基因组DNA提取液的配方为：Chelex 100 resin 5%；Tris-HCl 10 mM，pH8.3；乙二胺四乙酸二钠 0.1 mM；叠氮钠 0.1 %；蛋白酶K 200μg/ml。