[发明专利]一种质粒DNA提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子研究领域，具体的涉及一种质粒DNA提取方法。

背景技术

现有技术提取DNA采用碱裂解法，碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

碱裂解法的具体操作步骤为：取1.5ml培养物加入微量离心管中，室温离心12000g×1min，放弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽，残余液体可用移液枪吸净。

将细菌沉淀重悬于100μL预冷的溶液I(50mM葡萄糖，25mMTris-el，10mMEDTAPH：8.0)中，用振荡器剧烈振荡，使菌体分散混匀。

加200μL新鲜配制的溶液II(0.2MNaOH，1％SDS)，颠倒数次混匀(不要剧烈振荡)，并将离心管在室温下放置2min，使细胞膜裂解(溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清)。

加入150μL预冷的溶液III(乙酸钾，PH为4.8)，将离心管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置5min。溶液III为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K⁺使SDS-蛋白复合物沉淀。

取上清至一新离心管中，加入400μL的溶液IV(苯酚/氯仿/异戊醇)，振荡混匀，离心12000g×5min。

小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置5min，离心12000g×15min。

在1ml预冷的70％乙醇中洗涤沉淀1-2次，离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。

沉淀溶于20μLTE(10mMTris-cl，1mMEDTA，含RNaseA20μg/ml)，37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。

该方法提取质粒DNA的过程中具有以下几个缺点：

1.提取出来的质粒DNA纯度不高。可能是实验过程中杂蛋白和RNA去除的不干净，影响产物纯度。

2.提取的量太少，可能是实验中反应不完全，损失较多导致的。

3.实验过程中用到苯酚/氯仿/异戊醇等有毒试剂，不利于人员健康。

发明内容

本发明为了解决上述提到的现有的质粒DNA提取过程存在的缺点，提供一种DNA纯度高的质粒DNA提取方法。

具体地，本发明提供一种质粒DNA提取方法，其包括以下步骤：

S1、细菌的培养：挑选单一的菌落在含有抗生素的液体培养基中进行扩大培养，在35℃-40℃下培养12-16小时，将培养后的菌液无菌封装在至少两个离心管中，离心后，放弃上清；

S2、细菌的裂解：向离心管中加入溶液I，充分悬浮细菌沉淀，加入溶液II，缓慢翻转数次，充分裂解2-6min，之后加入溶液III，翻转数次至形成白色聚合物，室温放置2-4min，溶液I、溶液II和溶液III的摩尔比为1∶1∶1.4；

S3、质粒DNA的分离：将S2得到的溶液离心后，取上清放置在收集管的离心柱上；

S4、质粒DNA的收集：离心后，弃掉收集管内的废液，继续装载离心柱，向离心柱内加入清洗液A，离心后后弃滤液，之后向离心柱内加入清洗液B，离心后弃滤液并重复该步骤2-3次，将离心柱放入无菌工作台的无菌管内，加入预热后的TE缓冲液，静置1min，离心后去掉离心柱，无菌管内得到目的DNA，放入-20℃保存或者常温干燥保存，其中清洗液A和清洗液B的摩尔比为5∶7。

优选地，溶液I为25mMTris-cl与10mMEDTA高压灭菌后加入RNaseA0.1067mg/ml得到，其PH为8.0。

优选地，溶液II为0.2MNaOH与1％SDS。

优选地，溶液III为4M盐酸胍与0.5M醋酸钾，其PH为4.2。

优选地，清洗液A为5M盐酸胍、20mMTris-cl与浓度为37.5％乙醇的混合液，其PH为6.0。

优选地，清洗液B为浓度为80％的乙醇。

优选地，TE缓冲液为10mMTris-cl与1mMEDTA，其PH为8.0。

优选地，收集管的离心柱装载有硅胶膜。

本发明的优点如下所述：

本发明针对质粒DNA纯度不高，在相应的试剂中添加盐酸胍来溶解去除多余的杂蛋白。