[发明专利]检测甲霜灵残留的试纸及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测甲霜灵残留的试纸及其应用，具体涉及一种用于检测甲霜灵残留的胶体金试纸，其特别适用于烟草中甲霜灵的定性检测。

背景技术

甲霜灵（Metalaxyl），D,L-N-(2,6-二甲基苯基)-N-(2'-甲氧基乙酰)丙氨酸甲酯,是一种新型的具有保护和治疗作用的内吸性杀菌剂，可被植物的根、茎、叶吸收，并随植物体内水分运转而转移到植物的各器官，可以作茎叶处理、种子处理和土壤处理，对霜霉菌、疫霉菌、腐霉菌所引起的病害有效，在农业生产上常用来治疗葡萄霜霉病、黄瓜霜霉病、黄瓜角斑病、辣椒疫病、烟草黑胫病、马铃薯晚疫病、番茄晚疫病、水稻立枯病、水稻青枯病、水稻恶苗病、玉米茎基腐病、玉米丝黑穗病、谷子白发病等病害，在农业生产和管理中，用途广泛。

甲霜灵属苯基酰胺类，高效、低毒、低残留农药，其内吸和渗透力很强，施药30分钟即可在植物体内上下传导，对病害植株有保护和治疗作用，且药效持续期长，故残效期长，从而造成其在农作物上的残留。我国针对不同作物，制定了甲霜灵最大残留限量标准，其中黄瓜、辣椒、番茄的最大残留限量为0.5mg/kg,糙米的最大残留限量为0.1mg/kg，其他谷物最大残留限量为0.05mg/kg。在实际生产中，以2mg/kg作为烟草最大残留量判定标准。

从现有技术和相关检测标准看，目前针对甲霜灵残留的检测方法主要是仪器方法，最常用的方法是LC-UV、LC-MS和LC-MS/MS，仪器方法具备检测灵敏度高、特异性强等优势，但是检测样本前处理繁琐、耗时，样品还需提取和净化处理，同时仪器检测方法需要昂贵的大型仪器和设备，配备专业的检测技术人员，所以限制了其应用；胶体金免疫层析法具有特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低、适合于批量样品的筛选检测等优点，是理想的快速筛选手段，能够更好地满足现场快速检测的要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灵敏度高、操作简便、成本低、检测时间短的甲霜灵残留检测试纸。

本发明所提供的检测甲霜灵残留的试纸，包括样品吸收垫（1）、结合物释放垫（2）、反应膜（3）、吸水垫（4）和底板（7）；所述反应膜上具有包被有甲霜灵半抗原-载体蛋白偶联物的检测线（T线）（5）和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（C线）（6），所述结合物释放垫（2）包被有甲霜灵单克隆抗体-胶体金标记物。

所述甲霜灵偶联抗原是由甲霜灵半抗原与载体蛋白偶联得到，所述甲霜灵半抗原是由水解反应得到，所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。

所述甲霜灵单克隆抗体是以甲霜灵药物半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得；所述羊抗鼠抗抗体-胶体金标记物中的羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到的。

所述样品吸收垫（1）、结合物释放垫（2）、反应膜（3）、吸水垫（4）依次粘贴在底板（7）上，所述结合物释放垫1/3-1/2被覆盖于样品吸收垫下。

所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为玻纤、无纺布、滤血膜等；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；所述保护膜为PE材质保护膜。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸的方法，其包括步骤：

1）制备包被有甲霜灵单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫（2）；

2）制备具有包被有甲霜灵半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3）将1）和2）制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和PVC底板组装成试纸。

具体地说，步骤包括：

1）半抗原制备：甲霜灵溶于乙醇中，常温下搅拌加入10%NaOH水溶液，用TLC薄层板监测反应进行，直至没有原料或原料点很浅，停止反应，净化，甲醇重结晶，得水解产物，经核磁、红外和质谱鉴定，甲霜灵半抗原合成成功；

2）将甲霜灵半抗原与载体蛋白偶联，得到甲霜灵半抗原-载体蛋白偶联物；

3）用甲霜灵半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到甲霜灵单克隆抗体；

4）提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；

5）用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

6）将步骤3）制备的甲霜灵单克隆抗体加入步骤5）制备的胶体金中，得到甲霜灵单克隆抗体-胶体金标记物；

7）将甲霜灵单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合物释放垫上，37℃烘60min后取出，密封并置于干燥环境中保存备用；