[发明专利]一种菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物原生质体培养领域，具体涉及一种菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，该方法采用秋水仙素对菊苣原生质体进行诱导，得到四倍体再生植株。

背景技术

菊苣(Cichorium intybus L.)属于菊科，是多年生草本植物，为食、药及饲料三用作物，其根部含有丰富的菊粉、低聚及超高果糖，对人体健康十分有益,亦可深加工成为低热量的保健食品和咖啡替代品；软化菊苣可作鲜食用高档蔬菜；此外，菊苣还是一种高产优质牧草。

菊苣原产欧洲，于20世纪80年代初引进中国，开始了大面积试种和快速推广，具有良好的发展潜力。但是，菊苣的育种在国内基本处于空白，现用的品种几乎全部从国外引进，而这些国外品种在适应性和抗性等重要农艺性状上表现较差，必须加以改良。所以，我们迫切需要开展自己的育种工作，培育出更适合中国种植条件的，具有知识产权的菊苣新品种。

原生质体融合(即体细胞杂交)是比较实用的生物技术之一，可以用于常规育种方法无法完成的种间或属间远源杂交，获取更大的杂种优势，引进优秀的农艺性状(例如：适应性，抗病性，抗逆性等)，培育菊苣新品种或育种材料，丰富种质资源。原生质体培育是实施体细胞杂交的前提和基础，而菊苣的原生质体培育技术体系在国内尚未建立；虽然国外已有菊苣原生质体培育及融合等方面的报道(Rambaud 1996)，但无论在培养效率上，还是在技术内容及方法的实用性上，都需要加以改进和提高，才能加快我国的菊苣育种，尽快地培养出具有中国特色的新品种。

多倍体的离体诱导技术对菊苣的育种及改良十分有益，四倍体或三倍体等植株具有营养体“巨型性”的特点，可以大幅度提高其收获器官——块根的产量(增产30-50％)，同时还可提高菊苣有效成分的含量(如菊粉糖等)，以及改善抗病性、抗逆性和适应性。国内常规的菊苣多倍体诱导方法，通常是运用秋水仙素等化学药剂处理菊苣的器官，组织，愈伤组织或多细胞团，得到的多倍体植株往往伴有混倍体和嵌合体，需要反复多次的继代，分离培养，才能筛选出纯合的多倍体植株，其过程不但费工费时，而且纯合多倍体的诱导频率不高。国外利用原生质体融合技术，诱导出了菊苣四倍体，但是其四倍体的诱导频率低(Rambaud等，1996)。

因此，植物外植体培养领域的科研和实践中，需要一种利用菊苣原生质体培养，结合秋水仙素处理，能够一次性获得高效的纯合四倍体的诱导方法。

发明内容

本发明提供一种菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，该方法采用秋水仙素对菊苣原生质体进行诱导，得到四倍体再生植株。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种菊苣原生质体诱导纯合四倍体植物的方法，包括如下步骤：

酶解步骤：向二倍体菊苣培养材料中加入酶解液，进行酶解处理，得到酶解产物；将所述酶解产物进行收集处理，得到原生质体悬液；

纯化步骤：将所述原生质体悬液进行清洗处理，再加入蔗糖溶液进行纯化处理，得到纯化后的原生质体；

诱导步骤：将所述纯化后的原生质体放置于秋水仙素加倍液中，进行诱导处理，得到加倍后的原生质体；

细胞团和小愈伤组织培养步骤：将所述加倍后的原生质体用原生质体培养基YJ1进行清洗处理，再用原生质体培养基JY2进行包埋培养，得到细胞团和小愈伤组织；

愈伤组织繁殖和胚状体诱导步骤：将所述细胞团和小愈伤组织于原生质体培养基YJ3培养基进行诱导培养，得到愈伤组织和胚状体；

分化步骤：将所述愈伤组织和胚状体于分化培养基JY4进行分化培养，得到再生芽。

上述方法的优选的实施方式中，所述酶解步骤中，所述酶解液包括：质量百分比浓度为0.1-1.0％、优选为0.25％的纤维素酶R-10，质量百分比浓度为0.1-1.0％、优选为0.2％的果胶酶。

上述方法的优选的实施方式中，所述酶解步骤中，所述酶解液中还包括：10mM的CaCl₂·2H₂O，0.7mM的KH₂PO₄，质量百分比浓度为8％-12％的甘露醇，质量百分比浓度为0.05-0.2％的2-(N-吗啉)乙磺酸。

上述方法的优选的实施方式中，所述酶解步骤中，所述酶解处理的时间为5-6小时，优选为5.5小时。

上述方法的优选的实施方式中，所述诱导步骤中，所述秋水仙素加倍液中，含有质量浓度百分比为0.1-1％，优选为0.1-0.5％，更优选为0.3％的秋水仙素。