[发明专利]肝细胞无血清培养基

说明书

本发明公开一种肝细胞无血清培养基，其包括以下组分：基础培养基500mL；丝胶蛋白0.05～0.5％；地塞米松0.1～1000nmol/mL；肝细胞生长因子5～20ng/mL；表皮生长因子10～50ng/mL；青链霉素100U/mL。本发明肝细胞无血清培养基适合肝细胞的生长及功能发挥，可用于生物型人工肝的制备。

技术领域

本发明涉及一种动物细胞培养技术，尤其涉及一种肝细胞无血清培养基。

背景技术

生物人工肝支持系统(BALSS)是以具有一定功能的肝细胞为依托的，能够在一定程度上对人体发挥类似于肝脏功能的装置，一方面可以为可逆性肝功能损害患者提供短期的支持，顺利过渡至肝功能恢复，另一方面可以对不可逆性肝功能衰竭患者在等候肝移植期间给予支持，起到肝功能衰竭及肝移植之间的桥梁作用。肝细胞是BALSS的核心部分，因此体外培养肝细胞并使其发挥原有的生理作用，成为了BALSS研究的重点。以往肝细胞多使用人或动物血清进行培养，但由于其具有免疫排斥反应和致敏性，易受外源微生物污染等缺点，并不适应于人体应用。

一般细胞培养需要在基础培养基中加入5-10％动物血清，基础培养基含有适量的能量物质和微量元素等，而血清中含有细胞生长所必需的各种生长因子、激素及蛋白质等成分。目前用于肝细胞培养的基础培养基主要包括William’s E培养基，DMEM，DMEM/F12，RPMI-1640，M-199，ML-15等。传统含血清培养基的主要缺点在于1.由于种属特异性，异种动物血清具有免疫排斥反应和致敏性；2.血清内容易携带朊病毒等，且易受病原微生物污染；3.不同批次间可能存在差异，容易导致实验结果不可重复性；4.血清中某些蛋白成分可能对实验结果产生影响。

无血清培养基开发的思路关键在于，在基础培养基中添加适量的生长因子、激素、微量元素、促粘附物质等，使无血清培养基的作用接近于含血清培养基。目前已商品化的肝细胞无血清培养基较少，其中具有代表性的是HepatoZYME-SFM。HepatoZYME-SFM是目前肝细胞无血清培养基中的代表之一，但不同的肝癌细胞系，对培养基内各成分的需求并不相同，因此不同细胞系最适宜的培养基配方并不相同，HepatoZYME-SFM不具备广泛的通用性。

丝胶蛋白(sericin)是从蚕丝中提取的蛋白质，含大量侧链带亲水基团的氨基酸如丝氨酸、天冬氨酸等，分子量为10—400kDa，易溶于水中，在蚕营茧时起着黏合作用。目前丝胶蛋白已经被广泛应用于各种哺乳动物的细胞培养中，实验证实丝胶蛋白对多种体外培养的细胞的增殖和粘附能力均有明显的促进作用[2]。Nayak S[3]等的研究中，在2％海藻酸盐溶液中加入0.125％的丝胶蛋白，以此溶液将HepG2细胞按1×106/ml密度重悬，使用注射泵将细胞悬液以不同速率挤出不同大小的微珠，将微珠收集于含有0.2MCaCl2溶液的胶化浴中并静置15min，然后以0.5％壳聚糖溶液对微珠进行包裹30min，最后将微珠浸入京尼平溶液(2.5mg/ml，37℃，4h)中进行交联，从而制成微囊。经此微囊化培养的细胞，细胞活力及白蛋白、尿素合成功能均明显优于未加丝胶蛋白的对照组。

丝胶蛋白-藻酸盐-壳聚糖微囊化培养的缺点也非常突出，主要在于制作工序较复杂，不利于日常应用、广泛推广及肝细胞的产业化培养，且在包裹过程中溶液成分、渗透压的剧烈变化，容易导致细胞不可逆性损伤。

发明内容

本发明的目的是结合丝胶蛋白的优势，提供一种添加了适当浓度的丝胶蛋白的适用于生物人工肝的肝细胞无血清培养基。

为达到以上技术目的，本发明采用的技术方案如下：

一种肝细胞无血清培养基，其包括以下组分：

基础培养基500mL；

丝胶蛋白0.05～0.5％；

地塞米松0.1～1000nmol/mL；

肝细胞生长因子5～20ng/mL；