[发明专利]附着型慢病毒载体、制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种附着型慢病毒载体、制备方法及应用，属于生物技术领域。本发明中附着型慢病毒载体由pLRZM载体与包装系统共同转染宿主细胞获得，pLRZM载体为pLVX‑IRES‑ZsGreen1载体中土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件替换为人源性MAR序列或其95％以上同源序列所得，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件序列如SEQ ID NO.2所示，人源性MAR序列如SEQ ID NO.3中第14～2161位碱基所示。该附着型慢病毒载体附着于宿主细胞染色体上，而非整合到宿主细胞染色体中，并且能够介导外源基因在哺乳动物细胞中稳定、高效、持久的表达，可用于基因治疗，具有广阔的市场前景。

技术领域

本发明涉及一种附着型慢病毒载体，以及该附着型慢病毒载体的制备方法及应用，属于生物技术领域。

背景技术

随着对疾病分子机制认识的加深及生物技术的发展，基因治疗已成为治疗疾病的一种新途径，治疗的疾病也从遗传病扩展到感染性疾病、神经系统疾病以及肿瘤等。目前，用于基因治疗的载体系统可分为病毒性载体和非病毒性载体两类。慢病毒载体是一种特殊的逆转录病毒，与常用的逆转录病毒载体、腺病毒载体相比，不仅能感染分裂期细胞，还能感染非分裂期细胞(如神经细胞、造血干细胞、肌纤维细胞和肝细胞等)，并且具有容纳大片段外源性目的基因、不易诱发宿主免疫反应(免疫反应小、安全性好)等优点。慢病毒载体在基因治疗中具有广泛的应用前景，已成为当前基因治疗载体研究的热点。

典型的慢病毒载体系统为HIV-载体系统，由包装成分和载体成分两部分组成。包装成分由HIV-1基因组除去包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。

从慢病毒载体诞生至今，其安全性、滴度及转导能力等均有较大改进。第一代慢病毒载体系统以三质粒系统为代表，由包装质粒、包膜质粒及载体质粒3种质粒组成。包装质粒是HIV-1前病毒基因组5’端LTR由巨细胞病毒早期启动子取代，3’端LTR由SV40 polyA序列取代。包装成分分别构建在两个质粒上，一个表达gag和pol，另一个表达env。包膜质粒采用水疱性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)替代原病毒的env基因。载体质粒携带5’端LTR和全部5’端非翻译区域，另外还带有rev应答元件(RRE)。第二代慢病毒载体系统在第一代的基础上作出改进，即在包装质粒中删除HIV的所有辅助基因(如vif、vpr、vpu和nef基因)，在增加载体安全性的同时不影响病毒的滴度和感染能力。第三代慢病毒载体系统采用四质粒替代原有的三质粒系统，改进之处在于：1)将rev基因单独放在一个包装质粒上；2)增加两个安全特性，一是构建自身失活的慢病毒载体，删除U3区的3’LTR，使载体失去HIV-1增强子及启动子序列，即存在所有病毒蛋白也不能转录出RNA，二是采用异源启动子序列替代tat基因，仅保留原始HIV-1基因组中的gag、pol和rev。因此，第三代慢病毒载体系统更加安全、可靠。

虽然慢病毒载体的安全性、滴度及转导能力等均有所提高，但也存在以下问题，即现有载体必须整合到宿主细胞染色体上，而载体的随机整合会引起插入突变或导致转基因的沉默，严重影响载体在基因治疗中的应用。公告号CN101532031B的发明专利公开了一种非整合慢病毒载体系统，由pLVTH载体、pHelper 1.0载体和pCMV-VSV-G载体共同转染宿主细胞后，在宿主细胞中包装获得，其中pHelper 1.0载体为pCMV-dR8.2dvpr载体中HIV整合酶基因编码的HIV整合酶第257～259位氨基酸由IKV突变为AAH获得，该载体系统能够克服随机整合的缺点，但其持久稳定表达时间较短，15天左右表达目的基因的细胞个数较常规病毒减少70～80％。因此，构建高效安全的慢病毒载体是基因治疗中亟待解决的问题。