[发明专利]一种分子量内标及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新型分子量内标及其应用。尤其是涉及一种能清晰地分辨单个碱基、确保正确分型的分子量内标及其应用

背景技术

基因组扫描(genomescanning)是从全基因组的遗传标记中寻找与特定性状或基因紧密连锁的标记，并在染色体上定位相关基因的方法。而基因分型(Genotyping)又称为基因型分析(Genotypicassay)，是利用生物学检测方法测定个体基因型(Genotype)的技术，其中使用技术的包括聚合酶链反应(PCR)、DNA片段分析、寡核苷酸探针(ASOprobes)、基因测序、核酸杂交、基因芯片技术等。人类基因组计划开始以来，基因扫描和基因分型技术发展迅速。在致病基因筛查，疾病基因连锁和关联分型，肿瘤等疾病早期诊断、法医学个体识别等方面都广泛应用。基因分型技术重要的手段就是利用DNA测序仪或遗传分析仪分析基因片段的分子量。这类仪器分析分子量时需要一个分子量标准来对样品进行计算，也就是分子量内标，又称为分子量内对照(InternalLaneStandard)。

目前常用的分子量内标，如LIZ-500，其由15条带有LIZ荧光素(红色)标记的双链DNA片段组成，分子量分别是：35bp、50bp、75bp、100bp、139bp、150bp、160bp、200bp、250bp、300bp、340bp、350bp、400bp、450bp、490bp和500bp，这些DNA片段之间的分子量差都大于或等于10bp，是通过先对质粒酶切，再连接上一条带荧光素的寡核苷酸得到的内标片段。而在STR分型的过程中，由于遗传分析仪上Buffer槽中的Buffer、水槽中的水、毛细管以及POP胶和甲酰胺均会出现过期或不合格现象。而且也会出现很多的扩增片段，当扩增的片段比较大且大小相近，而标记引物颜色相同时，使用现有的DNASTR检测用标准物质即分子量内标检测DNA时就不能保证单个碱基分辨率，也就不能在Buffer槽中的Buffer、水槽中的水、毛细管以及POP胶和甲酰胺中某一部分出现过期或不合格时保证基因分型的正确。

发明内容

本发明针对现有分子量内标在使用时存在的不足，提供一种能清晰地分辨单个碱基，确保正确分型，从而方便操作人员判读的分子量内标及其应用。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案

一种分子量内标，由n条不同分子量的带有可识别的标记物的核苷酸片段构成；其中至少包含p对相差一个碱基的核苷酸片段对；所述相差一个碱基的核苷酸片段对中一个片段的碱基数为m，另一个片段的碱基数为m+1或m-1。

其中，在一些实施方案中，所述n为偶数时，p为1～n/2。即至少包含1～n/2对相差一个碱基的核苷酸片段。如n为10时，p可以为1～10/2。即可以包含1对、2对、3对、4对或5对相差一个碱基的核苷酸片段对。

在一些实施方案中，所述n为奇数时，p为1～(n-1)/2。即至少包含1～(n-1)/2对相差一个碱基的核苷酸片段。如n为11时，p可以为1～(11-1)/2。即可以包含1对、2对、3对、4对或5对相差一个碱基的核苷酸片段对。

在一些优选实施方案中，本发明所述分子量内标中p为2～6。即本发明所述分子量内标中包含2～6对相差一个碱基的核苷酸片段对。

在一些实施方案中，本发明分子量内标中所述的碱基数m在30～5000个之间。

在一些实施方案中，所述的碱基数m在30～1000个之间。

在一些优选实施方案中，所述的碱基数m在30～600个之间。

在一些实施方案中，本发明分子量内标中所述可识别的标记物为荧光标记物，其荧光发射区域在400nm至1000nm范围内。

优选地，所述的荧光标记物包括但不局限于以下荧光素：LIZ、FAM、HEX、JOE、TMR、TET、VIC、NH635、Cy5。

本发明还提供了所述的分子量内标在片段分析中的应用。

优选地，所述片段分析包括但不局限于STR分型、测序、大片段分析以及基因组分析。

本发明还提供了一种包括本发明所述的分子量内标的片段分析试剂盒。

本发明制备的分子量内标是带有荧光标记物的DNA分子。一般使用方法是加入去离子甲酰胺，95'C加热3-5分钟变性，迅速置于冰上冷却3分钟。