[发明专利]一种重组人Ⅰ型胶原蛋白及其固定化发酵生产的方法

权利要求书

1.一种重组类人Ⅰ型胶原蛋白，其特征在于，它的全长为344个氨基酸，由如SEQ ID No: 1所示的氨基酸以及在SEQ ID No: 1所示氨基酸的C端添加的GERGERGER组成。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.表达重组类人Ⅰ型胶原蛋白的毕赤酵母重组工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

a．PCR扩增目的基因

以权利要求2所述基因为模版，设计引物扩增目的基因，扩增引物如下：

上游引物：GCCTACGTAGAACAAGGCGTTCCAGGT

下游引物：GAATGCGGCCGCAGGCAGGCCAACAACACCACG

b．构建重组质粒 pPIC9K-rhCⅠ

纯化回收PCR产物，然后对载体pPIC9K和纯化后的PCR产物进行SnabⅠ和NotⅠ双酶切，T4连接酶体系连接回收目的片段和pPIC9K载体，转化至大肠杆菌DH 5α，涂布于含有氨苄青霉素的LB平板，菌落PCR筛选鉴定阳性转化子；

c．构建重组表达类人Ⅰ型胶原蛋白的毕赤酵母工程菌

使用SalⅠ单酶切线性化重组质粒pPIC9K-rhCⅠ，电击转化至感受态毕赤酵母GS115，用抗生素G418梯度筛选得到高拷贝工程菌株。

4.权利要求1所述蛋白的固定化发酵生产方法，其特征在于，用BMGY培养基，30~32℃，200~250rpm振荡培养权利要求3所述的毕赤酵母重组工程菌，当OD₆₀₀达到5.0以上时，5000×g 离心10~15min收集菌体，将菌体转移至BMMY培养基中进行培养，加入0.5% (v/v)甲醇诱导，每隔24h补充0.5% (v/v)甲醇，发酵结束后，离心收集发酵液上清，浓缩后，利用凝胶过滤层析法纯化，即得到重组类人Ⅰ型胶原蛋白；

所述BMGY培养基的配方为：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，无氨基酵母氮源13.4g/L，500×生物素2.0mL，甘油10 mL，1M磷酸钾100mL；

所述BMMY培养基的配方为：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，无氨基酵母氮源13.4g/L，500×生物素2.0mL，1M磷酸钾100mL。

5.一种连续生产重组类人Ⅰ型胶原蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）搭建固定化反应系统：由管路串联的普通发酵罐和固定化反应器组成，所述固定化反应器为纤维床反应器，其中固定化介质主要为棉纤维；

（2）将权利要求3所述毕赤酵母重组工程菌的种子液以10~15%（v/v）的接种量接种至普通发酵罐中，加入氨水调节pH达到5.0~5.5，温度控制在30~32℃，溶氧率为20%~30%，通气量为2 vvm，转速为800 rpm；当普通发酵罐中OD₆₀₀达到10及以上时，联通两个反应器之间的管道，从普通发酵罐中将培养基泵入纤维床反应器，使酵母菌细胞固定在纤维床反应器中的棉纤维上；

（3）当普通发酵罐中游离菌体浓度恒定且底物不再消耗，收获培养基进行蛋白纯化，同时添加新鲜培养基重新开始发酵。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，当发酵罐中溶氧突然上升时，开始流加50%（v/v）的甘油，流速为6.0~6.4mL/（L·h），时间约为24 h，停止流加甘油后，溶氧上升，培养0.5~1 h后，开始流加甲醇，流速为6.4mL/（L·h）；反应温度控制为24~26℃，pH调节至6.5，溶氧率维持在20%~30%，甲醇诱导时间为84h；更换新鲜培养基，进行下一轮固定化发酵培养。

7.根据权利要求5或6所述方法，其特征在于，所述普通发酵罐中培养基成分为：PTM1 4.35mL，H₃PO₄ 26.7mL，甘油40g/L，MgSO₄ 14.9g/L，K₂SO₄ 18.2g/L，CaSO₄ 0.93g/L，KOH 4.13g/L，(NH₄)₂SO₄ 10g/L。