[发明专利]一种红麻根结线虫分离鉴定方法

权利要求书

1.一种红麻根结线虫分离鉴定方法，其特征在于：所述方法包括形态学鉴定、同工酶分析鉴定、分子生物学鉴定。

2.根据权利要求1所述的一种红麻根结线虫分离鉴定方法，其特征在于：该方法按如下步骤进行：

（1）形态学鉴定：选取典型红麻根结线虫病病株，采用五点取样法采集寄主根系及周围5-20cm深的耕作层土壤500g，温室条件下将病根和病土接种到预先用灭菌土培植45d的盆栽番茄上进行纯化培养；在体视显微镜下，用解剖针从接种发病的番茄根中，挑取雌虫和卵块，将卵块放于盛有蒸馏水的培养皿中孵化4-5d即可得到根结线虫，用贝曼漏斗法分离土壤中的雄虫；获得虫体后，制作线虫玻片进行会阴花纹的形态鉴定；

（2）同工酶分析鉴定：运用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对纯化的根结线虫样本进行酯酶和苹果酸脱氢酶电泳分析；

（3）分子生物学鉴定：以纯化后的不同根结线虫种群为样本，提取其DNA，以引物5-GGTCAATGTTCAGAAATTTGTGG-3和5-TACCTTTGACCAATCACGCT-3进行PCR，扩增其位于线粒体DNA中的COll基因和lrRNA基因，将序列进行比对分析鉴定。

3.根据权利要求2所述的一种红麻根结线虫分离鉴定方法，其特征在于：步骤（2）具体方法为：挑取20头雌虫于1.5ml离心管中研磨提取酶样品，取20μL样品加入聚丙烯酰胺胶孔中，以爪哇根结线虫样品为对照进行电泳，待电泳结束后，取出胶片，用蒸馏水清洗两次，加入MDH染色液于暗室内进行苹果酸脱氢酶染色20min，用蒸馏水漂洗后加入酯酶染色液，于37℃水浴30min，完全显色后用蒸馏水漂洗3次，于固定液中固定2h后，用蒸馏水漂洗，拍照。

4.根据权利要求2所述的一种红麻根结线虫分离鉴定方法，其特征在于：步骤（3）中PCR反应体系为：0.25μLTaq，2.5μL10×Buffer,2μLdNTPMixture,引物各1μL，1.0ng模板，加水至25μL，扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸2min,35个循环，72℃延伸10min。