[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒S全基因扩增测序的方法及其应用有效
| 申请号： | 201510541403.1 | 申请日： | 2015-08-28 |
| 公开（公告）号： | CN105132585A | 公开（公告）日： | 2015-12-09 |
| 发明（设计）人： | 王亚欣;陈瑞爱;唐满华;赵大伟 | 申请（专利权）人： | 肇庆大华农生物药品有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93 |
| 代理公司： | 广州市越秀区哲力专利商标事务所(普通合伙) 44288 | 代理人： | 张耐寒 |
| 地址： | 526238 广东省*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 种猪 流行性 腹泻 病毒 基因 扩增 方法 及其 应用 | ||
1.一种猪流行性腹泻病毒S全基因扩增测序的方法，包括以下步骤：
1)提取猪流行性腹泻病毒RNA；
2)RT-PCR扩增：采用如SEQIDNo.1所示上游引物和如SEQIDNo.2所示下游引物，对步骤1)提取的RNA进行RT-PCR扩增，得到SCX1基因PCR产物；采用如SEQIDNo.3所示上游引物和如SEQIDNo.4所示下游引物，对步骤1)提取的RNA进行RT-PCR扩增，得到SCX2基因PCR产物；
3)基因片段回收：将步骤2)所得的SCX1基因PCR产物和SCX2基因PCR产物进行核酸电泳，回收SCX1基因片段和SCX2基因片段，并测序；
4)拼接：将步骤3)获得的SCX1基因片段与SCX2基因片段进行拼接，得到猪流行性腹泻病毒S全基因，测序。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，取病料经2000rpm离心5min，-20℃反复冻融2-3次，采用E.Z.N.A.ViralRNAKit提取试剂盒提取病料的RNA。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，取PEDV的细胞培养物上清液，-20℃反复冻融2-3次，采用E.Z.N.A.ViralRNAKit提取试剂盒提取病料的RNA。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述RT-PCR扩增的反应体系：2μLPrimeScript1stepEnzymeMix，25μL2×1stepbuffer，1μL上游引物(20uM/μL)；1μL下游引物(20uM/μL)；1μL模板RNA；ddH2O补足至50μL。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述RT-PCR扩增的反应程序：50℃30min，94℃2min；94℃30s，55℃30s,72℃2min30s，设置30个循环。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，采用PrimeScriptOneStepRT-PCRkitVer.2试剂盒进行RT-PCR扩增。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，去除步骤3)获得的SCX1基因片段与SCX2基因片段的重复碱基，进行拼接。
8.如权利要求1所述的方法在定性检测猪流行性腹泻病毒中的应用。
9.如权利要求1所述的方法在猪流行性腹泻病毒同源性分析中的应用。
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