[发明专利]一种发酵制备富马酸的工艺

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种发酵制备富马酸的工艺。

背景技术

富马酸（Fumaricacid）作为一种重要的有机基本化工原料和大宗化工产品，广泛应用于涂料、树脂、医药、增塑剂、食品添加剂等领域，具有重要的市场价值。同时，以富马酸为原料可以进一步合成多种高价值衍生物，如富马酸二甲酯（DMF）、富马酸亚铁等。另外，富马酸作为一种重要的四碳平台化合物，还可以通过酶催化转化、酯化、加氢等工艺生产L-天冬氨酸、苹果酸、琥珀酸、马来酸、1,4-丁二醇、γ-丁内酯和四氢呋喃等四碳化合物。

目前工业上生产富马酸主要采用化学法，发酵法生产富马酸并未实现工业化，其主要原因是原料费占富马酸生产的很大一部分，降低原材料成本成为生物法制备富马酸的唯一出路，目前生产富马酸的菌主要是米根霉，为了降低原料成本，考虑利用淀粉质原料生产富马酸，但是需要将淀粉质原料通过液化和糖化转化成葡萄糖后再利用，此工艺复杂，而且液化和糖化同样增加了成本，目前，已有文献报道，直接利用米根霉液化液进行同步糖化发酵富马酸，虽然取得了好的效果，但是发酵过程中后期糖耗低，终点残糖含量高，从而导致发酵能耗高、成本高，设备利用率低等。

发明内容

本发明提供了一种发酵制备富马酸的工艺，利用低浓度的淀粉液化液分批发酵，在中后期再向发酵系统中补加一定的淀粉液化液和糖化酶，既避免了高初糖浓度对富马酸发酵的抑制，又可解决后期因菌自身糖化酶活力降低导致糖耗低的问题，同时提高了菌种的利用率，糖酸转化率和设备利用率，降低了生产成本。

为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是这样的：一种发酵制备富马酸的工艺，包括以下步骤：

1）将淀粉液化液加入种子罐中，同时添加尿素和无机盐，调整pH至2.5-3.5，灭菌后接入米根霉孢子悬浮液，进行种子液培养；

2）将淀粉液化液加入发酵罐中，灭菌后接入经步骤1）培养好的种子液，并向其中加入分消的碳酸钙；

3）待发酵32-38h，将淀粉糖化液和糖化酶作为流加液以20-25mL/h的流加速度向发酵罐内流加，流加液的总加入体积为初始发酵体积的10%-15%，其中，流加液中淀粉糖化液的总糖浓度为60-80g/L,糖化酶的酶活力为4.5×10^5-6.7×10⁵U/mL。

初糖总糖过高则抑制菌体生长，初糖总糖过低则菌体生长旺盛，抑制磷酸果糖激酶的活性，降低菌体发酵前期产酸速率，因而所述的发酵罐中淀粉液化液的初始总糖浓度优选为40-60g/L。

优选地，所述的淀粉液化液的具体制备过程：淀粉质原料与水以8-12%（w/v）的比例混合成糊状后，加热到70-80℃，加入耐高温淀粉酶，加酶量为800～1000U/g干淀粉质原料，保温10-20min后继续加热到90-95℃，碘检不变色后继续加热到100℃煮沸5～10min，然后趁热经过3-4层纱布过滤，滤液冷却后加水调整糖度。

优选地，所述的淀粉糖化液的具体制备过程为：将淀粉液化液加热至50—60℃，加入糖化酶，保温4-5h，无水酒精检验无糊精存在后，继续加热至70-80℃，保温10-30min，冷却后加水调整糖度。

富马酸的发酵需要的低氮的条件下进行，为了控制淀粉质原料中的氮含量，所述的淀粉质原料优选自可溶性淀粉、玉米粉、脱胚玉米粉、木薯粉之中的一种或2种的组合。

优选地，种子罐中淀粉液化液的总糖浓度为25-25g/L。

优选地，尿素的添加量为2-2.5g/L。

优选地，所述的无机盐为KH₂PO4，MgSO₄·7H₂O，ZnSO₄和FeSO₄·7H₂O，浓度分别为0.5-0.6g/L，0.4-0.55g/L，0.08-0.15g/L，0.08-0.09g/L。

优选地，种子液接种于发酵罐的接种量为10-15%。

通过研究发现，生产富马酸的米根霉，其自身具有糖化酶，可直接利用淀粉质原料的液化液来生产富马酸，但是，由于米根霉自身的具备的糖化酶活力不高，在发酵中后期受到发酵产物的抑制，活力进一步下降，因而其利用淀粉质原料液化液来生产富马酸时，容易造成后期糖耗低，终点残糖含量高。

有益效果：