[发明专利]一种依据遗传背景的微营养素矫正人基因组损伤的方法

权利要求书

1.一种依据遗传背景的微营养素矫正人基因组损伤的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)血液叶酸水平检测：

S1.血清获得：用促凝管采集个体外周血，然后放于4℃凝血1h，2500rpm离心15-20min，黄色的上清为血清，分装为每个300μl，放于-20℃避光保存；

S2.血清叶酸水平检测：血清样本放室温解冻半小时后，将样本加入BECKMANAccess2全自动免疫分析仪进行检测，得到受检样本血清叶酸值；

S3.红细胞获得：EDTA-抗凝管采集个体外周血，1000rpm离心5-10min分离红细胞，用生理盐水洗三次红细胞，1000rpm离心5min，将红细胞按1:21的比例稀释于质量浓度为0.2％的抗坏血酸溶液中，使细胞破碎，-20℃避光保存；

S4.红细胞叶酸检测：将破碎的红细胞样本放室温解冻半小时后，将样本加入BECKMANAccess2全自动免疫分析仪进行检测，得到受检样本红细胞叶酸值；

(2)血清VB12和Hcy水平检测：

S1.血清获得：用促凝管采集个体外周血，然后放于4℃凝血1h，2500rpm离心15-20min，黄色的上清为血清，分装为一个300μl，放于-20℃保存；

S2.血清VB12水平检测：血清样本放室温解冻半小时后，将样本加入BECKMANAccess2全自动免疫分析仪进行检测，得到检测样本血清VB12值；

S3.血清VB12水平检测：血清样本放室温解冻半小时后，将样本加入生化分析仪HITACHI7600，检测样本血清Hcy值；

(3)MTHFR基因型分析：

S1.DNA提取：

取外周全血200μl用北京天根公司DNA抽提试剂盒进行DNA抽提；

S2.PCR扩增25μl体系：

677引物序列：677F5ˊ-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3ˊ

677R5ˊ-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3ˊ

确定677位点反应体系，进行677位点的PCR程序；

1298引物序列：1298F5ˊ-ATGTGGGGGGAGGAGCTGAC-3ˊ

1298R5ˊ-GTCTCCCAACTTACCCTTCTCCC-3ˊ

确定1298位点反应体系，进行1298位点的PCR程序；

PCR结束后，2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物结果：含677位点的扩增片断为198bp，含1298位点的扩增片断为241bp，剩余产物于-20℃冷冻保存；

S3.限制性酶切：

A、HinfⅠ酶切677PCR产物

依次加入10×Buffer2μl，10μlPCR产物，1μlHinfⅠ10U限制性内切酶，灭菌双蒸水补至终体积为20μl，37℃水浴1h以上70℃灭活15min，3％琼脂糖凝胶电泳检测：CC型为单一198bp，CT型为198和175bp，TT型为单一175bp；

B、MboⅡ酶切1298PCR产物

依次加入10×Buffer2μl，10μlPCR产物，1μlMboⅡ10U限制性内切酶，灭菌双蒸水至终体积为20μl，37℃水浴1h后70℃灭活15min，3％琼脂糖凝胶电泳检测：AA型为单一204bp，AC型为241和204bp，CC型为单一241bp；

S4.琼脂糖凝胶电泳及检测确定个体基因型：

A、制胶：称取3％琼脂糖，溶于0.5×TBE中，微波炉加热，充分溶解后，按比例加入核酸染料，摇匀，倒入制胶槽，室温放置，待其凝固；

B、琼脂糖凝胶电泳：加入10μl酶切产物点样，电压为100V，时间50-60min；

C、紫外检测：紫外分析仪检测电泳结果，根据检测结果确定PCR结果及两个位点的基因型；

(4)评价与营养干预：

红细胞叶酸高于700nM、血清叶酸高于34nM、血清VB12高于300pM，以及血清Hcy低于8μM是各种微营养素及代谢产物维护基因组稳定的参考值，对比参考值，结合个体MTHFR两个位点的基因型和基因组损伤状况，判断相关微营养素的是否缺乏，给予一定的营养干预策略，MTFHR两位点突变的个体应适当提高叶酸和VB12的摄入剂量，干预4-6个月后，复检各生化指标及个体的基因组损伤，判断微营养素干预对不同个体基因组损伤的矫正效果。