[发明专利]一种生物相容性良好的异种脱细胞真皮基质的制备方法

权利要求书

1.一种生物相容性良好的异种脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，其具体包括如下步骤：

(1)制备断层皮片

取0.1-2.0mm厚的动物断层皮片，裁成长、宽、高所需尺寸，PBS液洗涤，0.1%新洁尔灭去脂，再用PBS液洗涤；

(2)分离表皮和真皮

将步骤(1)得到的断层皮片用质量体积比为g/100ml 的0.1%～0.3%的胰蛋白酶的PBS液在4℃-20℃下，浸泡6-36h，依次用乙醇、双氧水和纯水洗涤，最后PBS洗涤；

(3)脱细胞处理

将步骤(2)处理后的材料先用质量体积比为g/100ml 的0.1～0.5%SDS水溶液洗涤1～6小时，再用水溶性含羟基化合物的水溶液洗涤，然后用纯化水洗涤，最后PBS液洗涤；

所述水溶性含羟基化合物包括羧甲基壳聚糖或水溶性醇类，浓度为2~10%，用水溶性含羟基化合物的水溶液洗涤的洗涤时间为1～6小时；

(4)交联

将步骤(3)处理后的材料用0.024～0.1mol/L的交联液交联，按每片脱细胞动物皮干重对应215ml交联液反应，反应结束后，用0.1mol/L磷酸氢二钠洗涤，再用纯化水洗涤；

(5)病毒灭活

将步骤(4)处理后的材料用0.2～1.2mol/L氢氧化钠浸泡30～60分钟，纯化水洗涤至中性；

(6)精制

将步骤(5)处理后的材料用乙醇洗涤，再用纯化水充分洗涤；

（7）Co-60辐照灭菌

将步骤(6)处理后的材料密封在生理盐水中，经Co-60所产生的γ射线辐照消毒灭菌，即得成品。

2.根据权利要求1所述的一种生物相容性良好的异种脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，所述的PBS液的配制方法如下：

NaCl8.00g/L；

KCl0.20g/L；

Na₂HPO₄1.56g/L；

KH₂PO₄0.20g/L；

将上述各成分依次溶解于含有800ml水的容量瓶中，补加水至1000ml，混匀。

3.根据权利要求1所述的一种生物相容性良好的异种脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中用乙醇、双氧水洗涤为用40%~75%乙醇洗涤6～12小时，3%双氧水洗涤15分钟。

4.根据权利要求1所述的一种生物相容性良好的异种脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，水溶性含羟基化合物的水溶液为乙醇溶液。

5.根据权利要求4所述的一种生物相容性良好的异种脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，乙醇溶液的浓度为4%，洗涤时间为1～6小时。

6.根据权利要求1所述的一种生物相容性良好的异种脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中的交联液通过如下方法配置：以浓度为0.05mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES)水溶液为交联液溶剂，先向其中加入EDC.HCL，然后再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，所述EDC.HCL和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的质量比为2：1～8：1，交联液浓度为0.024～0.1mol/L。

7.根据权利要求1所述的一种生物相容性良好的异种脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中用20%-50%乙醇洗涤。

8.根据权利要求1所述的一种生物相容性良好的异种脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中用40%乙醇洗涤。

9.根据权利要求1所述的一种生物相容性良好的异种脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)制备断层皮片

取0.1-2.0mm厚的动物断层皮片，裁成长、宽、高所需尺寸，PBS液洗涤，0.1%新洁尔灭去脂，再用PBS液洗涤3-6次；

(2)分离表皮和真皮

将步骤(1)得到的断层皮片用质量体积比为g/100ml 的0.1～0.3%的胰蛋白酶的PBS液在4℃-20℃下，浸泡16-36h，用乙醇洗涤，用70%乙醇洗涤6～12小时，3%双氧水洗涤15分钟，然后用PBS洗涤，3～6次，然后再用纯化水洗涤12～24次，隔1小时换液；

(3)脱细胞处理

将骤(2)处理后的材料用质量体积比为g/100ml 的0.1～0.5%的SDS水溶液洗涤1～6小时，用浓度为2~10%的水溶性含羟基化合物水溶液洗涤，1～6小时，继续用纯化水洗涤12～24次，每隔1小时换液，最后PBS液洗涤12～24次，每隔两小时换液；

所述水溶性含羟基化合物包括羧甲基壳聚糖或水溶性醇类；

(4)交联

将步骤(3)处理后的材料用0.03～0.1mol/L的交联液交联，按每片脱细胞动物皮干重对应215ml交联液反应，于25℃条件下交联4小时，80转/分；反应结束后，用0.1mol/L磷酸氢二钠震荡洗涤，120转/分，洗涤4次，每隔30分钟换液，然后纯化水洗涤4次，120转/分，每隔30分钟换液；

(5)病毒灭活

将步骤(4)处理后的材料用0.2～1.2mol/L氢氧化钠浸泡30～60分钟，纯化水洗涤至中性；

(6)精制

将步骤(5)处理后的材料用40%乙醇洗涤，洗涤12次，每次间隔一小时，然后用纯化水充分洗涤；

（7）Co-60辐照灭菌

用双层铝箔袋包装将步骤(6)处理后的材料密封在生理盐水中，经Co-60所产生的γ射线辐照消毒灭菌，即得成品。