[发明专利]黄绿蜜环菌中染料木素单体化合物的提取方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及药物化学及生物医药技术领域，具体涉及一种黄绿蜜环菌中染料木素单体化合物的提取方法，以及该染料木素单体化合物在制备抗肝癌药物和抗肺癌药物中的应用。

背景技术

黄绿蜜环菌(Armillarialuteo-rivens)，又名黄蘑菇、金蘑菇、黄环菌，隶属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、蜜环菌属。黄绿蜜环菌子实体中等大，菌盖扁半球形至平展，直径5-12cm，菌盖边缘内卷，表皮开裂形成近环状排列的纤毛状后磷片。菌褶近似菌盖色，稍密，弯生，不等长。菌柄柱形，茎部膨大，长2-10cm，直径2-2.5cm，白色或或带黄色，内实。菌环中位，单层，菌环以上为白色，菌环以下为黄色鳞片。在显微镜下观察，担孢子椭圆形，无色至微黄色，淀粉质，担孢子棒状，无色，具4个孢子，菌丝具明显锁状联合。菌丝分布在土壤5-10cm。该菌夏秋季生于针叶林地或草地上，尤其喜生于高山草地上，菌丝可与主要植被为嵩草和高山杂类草等形成菌根。在牧草生长季节，由黄绿蜜环菌菌丝顶端生长，在草地上形成或大或小的圆圈、半圆或条带状的蘑菇圈。圈的宽度大约为50cm，圈的直径大约6cm左右(周连玉.黄绿蜜环菌的研究概述.安徽农学通报[J].2010,16(3):52-54)。

国内对黄绿蜜环菌营养成分进行了初步分析，富含氨基酸、蛋白质、多糖多肽等营养和药用成分，具有较高的保健和药用价值。但目前的蜜环菌制剂主要以初提混合物为原料，如郭顺星等在“蜜环菌的化学成分及应用研究”(微生物学通报[J].1996,23(4):239-240)中提出：蜜环菌糖浆以蜜环菌培养液(菌丝连同发酵液)为主要原料，煮沸浓缩制成，主治眩晕头痛，神经衰弱，失眠，美尼尔综合症；蜜环菌浸膏以菌丝体为原料，煮沸、过滤，残渣醇析，醇析物与滤液合并浓缩制成，用于治疗血管性头痛、神经衰弱、冠心病、脑动脉血管硬化等病；蜜环菌片以菌丝体烤干后磨成细粉压片而成，对高胆固醇血症、高甘油三酯血症、降低血压有一定效果。由于蜜环菌制剂成分一般为混合物，缺乏必要的药效物质基础和药效研究，所以其缺乏合理的质量控制标准，难以确保临床用药的有效性、安全性、可持续性。可见，对黄绿蜜环菌的化学成分进行进一步提取和研究非常有必要。

袁兴利等在“蜜环菌的化学成分研究”(中国中药杂志[J].2013,38(16):2671-2674)提出以蜜环菌发酵培养物(包含菌丝体和发酵液)为原料进行有效成分提取：采用95％乙醇浸提后，用闪式提取器提取，合并提取液并浓缩；经两次硅胶柱色谱和一次Sephadex LH-20色谱柱，并使用不同的洗脱剂进行分离纯化后，得到染料木素(化学名化学名5,7,4’-三羟基异黄酮；金雀异黄酮)单体化合物。但是使用该方法步骤繁琐，成本高，得到的染料木素含量少，得率比较低，3.5kg干燥的蜜环菌发酵培养物只得到42mg染料木素，这大大限制了染料木素的进一步研究和应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种黄绿蜜环菌中染料木素单体化合物的提取方法，该方法采用二维高效液相色谱进行分离纯化，得到具有生物活性的染料木素单体化合物，分离方法稳定，重复性高，制备量大，操作简单省时，成本低，染料木素提取率高。

本发明所采用的技术方案为：

一种黄绿蜜环菌中染料木素单体化合物的提取方法，该方法包括以下步骤：

(1)以黄绿蜜环菌子实体为原料，经干燥并磨成粉末状后，用乙酸乙酯以液固比(5-10)mL︰1g进行浸泡，然后过滤取上清，得到乙酸乙酯提取液，并浓缩至膏状；

(2)使用乙醇体积分数为10-35％的正己烷-乙醇二元混合溶剂溶解步骤(1)得到的膏状乙酸乙酯提取物，得到100-150mg/mL的上样溶液；

(3)对上样溶液进行一维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙醇，进样量为50-150mL/针，流动相流速为550-600mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210-260nm；采用的洗脱方式为B相浓度由0％至75％(即按体积百分比B相75％、A相25％混合而成的液体，其他同理)进行梯度洗脱45-50min，根据紫外吸收光谱收集26-29min洗脱液作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分；

(4)用乙醇体积分数为2-15％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为50-100mg/mL；