[发明专利]疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因、工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因、工程菌及其应用，该疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。本发明在不改变现有的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶氨基酸序列和蛋白结构的基础上，通过避免稀有密码子和密码子对、强的茎环结构和潜在的提前终止信号等不利于蛋白表达的因素，优化了疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因序列，使得该序列在毕赤酵母重组表达系统中能够高效表达疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶，表达活力高达370.65U/ml，较疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因原始序列的重组表达活力234.03U/ml，提高了58.38％。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因、工程菌及其应用。

背景技术

脂肪酶(E.C.3.1.1.3)亦称酰基甘油水解酶，在自然界中主要催化三酰甘油酯的水解，还可在非水相条件下催化酯化、酯交换反应、醇解反应和酶解等反应。另外，脂肪酶具有多种底物特异性，如脂肪酸特异性脂肪酶，位置特异性脂肪酶和立体特异性脂肪酶等。脂肪酶的催化多样性和底物专一性等特征使其在粮油生产、食品工业、日用化学工业、油脂化学工业、农业化学工业、造纸工业、洗涤剂工业以及药物合成等许多领域得到广泛应用。

sn-1,3，位置专一性脂肪酶，在油脂生产和油脂化工方面，应用潜力巨大；利用其位置专一性催化性能，可改变脂肪酸在甘油脂中的位置，将廉价的油脂原料加工成昂贵的功能性结构脂，如类可可脂、1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(OPO)和甘二酯等。然而，sn-1,3专一性脂肪酶成本较高，使其进一步应用受到限制。

降低脂肪酶制剂生产成本的有效途径包括：(1)通过传统微生物遗传育种方法改良脂肪酶生产菌株；(2)构建模式微生物的重组工程菌异源表达脂肪酶基因，以提高脂肪酶表达效率；(3)对产脂肪酶菌株发酵表达的工艺优化以及下游分离纯化优化；(4)通过酶固定化以及改善酶催化反应条件提高脂肪酶的反应效率和利用效率；(5)通过定向进化和理性设计等分子生物学对酶蛋白改造，改善脂肪酶的理化性质和催化性质提高脂肪酶的催化比活力等。

毕赤酵母重组表达系统在短短二十年里受到广泛关注，并迅速发展成为当前最有效、最方便的外源蛋白表达系统之一。毕赤酵母作为异源蛋白重组表达系统有以下优点：生长周期短、培养成本低、易于培养条件，适合大规模工业化生产；遗传背景清晰，易于分子和遗传改良操作；具有强启动子，转录、翻译表达和分泌外源基因的能力强，许多蛋白可达到每升克级或以上水平；具有真核系统的糖基化等翻译后修饰能力；自身分泌的蛋白少，减少检测、分离纯化的背景干扰；发酵工艺成熟，在氧气充足的条件下能够实现酵母细胞的高密度发酵；外源基因通过同源重组方式整合，遗传稳定性高等。

随着分子生物学和基因工程等领域的飞速发展，影响蛋白表达水平相关的因素和技术不断被阐释和掌握，如基因密码子的偏爱性、基因拷贝数、启动子转录效率、核糖体结合位点、分泌信号肽的转运效率、内质网和高尔基体内蛋白翻译后修饰以及宿主蛋白酶对目的蛋白的降解量等。并且这些因素和技术都被成功地应用于重组表达系统中以提高目的蛋白的表达水平。

发明内容

本发明提供了一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因、工程菌及其应用，含该基因序列能够在巴斯德毕赤酵母菌中高效表达疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶，且表达量和酶活力均较高。

一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因，碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

该脂肪酶基因是在现有的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶编码基因序列(SEQ ID NO.3)的基础上，进行的优化和改良，以提高毕赤酵母中疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的表达量。

该改良的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因序列的设计原则为：

(1)密码子和密码子对的偏爱性要与异源表达宿主巴斯德毕赤酵母的偏爱性接近，防止稀有密码子和稀有密码子对阻碍翻译的有序进行，从而提高目的蛋白的表达水平；