[发明专利]水中诺如病毒的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及水体中诺如病毒的检测方法。

背景技术

诺如病毒为目前国际上报道最重要的非细菌性腹泻病原体，在我国诺如病毒的爆发也时有报道。但目前国内外对诺如病毒的研究均以人群的粪便和海鲜品标本为主，针对湖、河等水体中诺如病毒的检测报道较少。诺如病毒在水中虽然比较稳定但无法增值,导致难以检测。

浙江省杭州地区最近几年发生多起诺如病毒爆发疫情，有几起疫情流行病学资料都把传染源指向水源，但缺乏有效的水源中诺如病毒检测方式使疫情的传染源一直得不到确认。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种水中诺如病毒的检测方法，具有极高检测灵敏性和准确度，极大减少取样量，方便检测工作，降低检测成本。

水中诺如病毒的检测方法，其特征在于所述检测方法包括以下步骤：

(一)第一步浓缩

(1)、取水样500ml-1000ml,使用滤纸进行初过滤，去除水样的杂质；

(2)、过滤后的水样中加入Mg²⁺，用盐酸调节水样使pH＝3-4；然后采用过滤装置使水样通过孔径为0.45μm混合纤维素酯膜；

(3)、将滤过后的混合纤维素酯膜剪碎并随后放入10ml牛肉膏浸出液,超声振荡洗脱后离心，取上清液；

(二)第二步浓缩

将所述上清液分批加入离心超滤管进行高速离心超滤；

(三)对经第二步浓缩后的样品进行诺如病毒的检测。

本发明提供了一种适合基层使用的简单易行的诺如病毒检测方法。本方法简单高效，试剂成本比较低，样品量达到数百毫升就可以进行检测，不受水质水量影响，避免了巨量体积采样而导致的检测实际不可执行的问题，有很高的应用价值，适合基层疾控进行应用和推广。

本发明对诺如病毒的灵敏度为3copy/μl，具有极高的灵敏度，能够完全满足实际要求。

本发明对诺如病毒具有极强的特异性，不浓集病毒以外的物质。

附图说明

图1为实施例4中的地表水检测荧光PCR检测图谱

图2为实施例4中的JV12/JV13PCR扩增电泳图

具体实施方式

实施例1，对水体中诺如病毒的检测

(一)第一步浓缩(微孔滤膜吸附法)

1、对待测水体中取样500ml水样，使用滤纸进行初过滤，本步骤主要去除水样的杂质，因为病毒颗粒较小，所以能够顺利通过滤纸。

2、过滤后的水样中加入10毫升2.5mol/L的MgCl₂，使其终浓度达到0.05mol/L；用1mol/L的盐酸调节水样使pH＝3.5；然后采用过滤装置使其通过孔径为0.45μm混合纤维素酯膜；病毒颗粒在水中带负电荷，阳离子Mg²⁺和低pH值等条件可以使混合纤维素酯膜滤膜带正电荷,从而吸附带负电荷的病毒。

3、将病毒吸附在滤膜后，将滤过后的混合纤维素酯膜剪碎并随后放入10ml3％的牛肉膏浸出液,超声振荡洗脱2min(75w，超声时间和间隔时间均为5s)后3000r/min离心15min后取上清液。牛肉膏浸出液为蛋白类物质,它的pH值比较高。在较高的pH值下，在超声震荡的作用下，可以同病毒竞争吸附位点,从而使膜上的病毒从滤膜洗脱下来并进入了上清液。

经第一步浓缩后，500毫升的水中的病毒被浓缩至10毫升上清液中。病毒回收率58％左右。

(二)第二步浓缩(超滤法)

将10毫升上清液分批加入10kd离心超滤管(规格：4毫升)对进行超滤，过滤条件为3500转离心12min，浓缩后的体积为1.5ml左右。离心超滤管有一个类似于内管和外管的两个部分，内管中是带有一定分子量的膜，当高速离心时，分子量比它小的就漏到下面的管子(即外管)中了，分子量比它大的就截留在上面(即内管中)。通过第二步浓缩进一步提高病毒浓缩效率。

(三)对浓缩至1.5ml的样品采用荧光定量RT-PCR方法、普通RT-PCR方法、酶联免疫吸附测定(ELISA)等方法检测诺如病毒。

实施例2，灵敏性试验

对诺如病毒模拟样品使用微孔滤膜吸附法进行过滤，对其产物使用超滤法进行第二次浓缩(方法同实施例1)。每个样本浓度相差10倍，计算浓缩的回收率。对诺如病毒模拟样品使用荧光定量技术计算方法的检测灵敏度，本发明对诺如病毒浓缩的灵敏度为3copy/μl，具体见表1。

表1两步浓缩法对诺如病毒浓缩的灵敏度分析(浓度单位：copy/μl)