[发明专利]一种检测葡萄卷叶伴随病毒3号实时荧光PCR的DPO引物及试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测葡萄卷叶伴随病毒3号实时荧光PCR的DPO引物及试剂盒。本发明的DPO引物由SEQ ID No.1所示的单链DNA分子和SEQ ID No.2所示的单链DNA分子组成。通过实验证明：本发明的DPO引物特异性强、灵敏度高，而且运用本发明的葡萄卷叶伴随病毒3号的检测方法可以准确、简便和快速的检测葡萄卷叶伴随病毒3号，对进出口相关货物及产品检验检疫、病害防治预测具有指导意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测葡萄卷叶伴随病毒3号实时荧光PCR的DPO引物及试剂盒。

背景技术

葡萄卷叶病毒病(Grapevine leafroll-associated virus，GLRaV)是仅次于葡萄扇叶病毒病的一种世界性葡萄病毒病，在国内分布也较为普遍，田间感病率较高，对葡萄产量和品质影响很大，且引起该病的病毒是由多种病毒单独或复合侵染造成。现已报道的葡萄卷叶伴随病毒有11种，分别为GLRaV-1～9、GLRaV-Dr和GLRaV-De，我国已明确鉴定的葡萄卷叶伴随病毒种类共有6种，即GLRaV-1～5和GLRaV7。GLRaV已被证明属于典型的Clostero病毒，仅在韧皮部和叶片存在，其传播不是靠机械，通常是靠感染的母株或接穗等繁殖材料。GLRaV具有半潜隐性，对葡萄的生长发育有显著影响，通常会导致葡萄植株的生长衰弱、果实成熟延迟、果粒大小不均、着色不良、含糖量减少和产量下降。

目前，检测葡萄卷叶病毒的方法主要基于PCR的方法。但传统引物存在特异性不强、容易出现加阳性等缺点，而且传统PCR的结果判断需要电泳，增加了检测所需的时间。DPO(Dual priming oligonucleotide)引物技术的主要原理为其引物包含两个各自独立的特异性引物区域，5′端序列由18-25个碱基组成并与靶基因序列配对，3′端序列由6-12个碱基用来引导PCR反应的特异性延伸，这两段独立的特异性区域利用寡聚次黄嘌呤(Inosine,I)进行连接，由于次黄嘌呤比一般碱基的退火温度低，在退火时寡聚次黄嘌呤形成类似泡状的结构，从而使5′和3′区域形两个独立功能的双特异性引物结构，并且研究表明5′和3′引物区域中任何有3个及以上碱基的错配，PCR反应将不能进行。

SYBR Green I是一种小分子DNA染料，游离时不会发射任何荧光信号，但当与双链DNA特异地结合时，荧光染料掺入DNA双链，发射出强烈的荧光信号，同时PCR产物的特异性可以用熔解曲线分析进一步确认，利用SYBR Green I这一特性建立的实时荧光PCR在植物病原菌检测方面已广泛应用。DPO(Dual priming oligonucleotide)引物包含两个各自独立的特异性引物区域，5′端序列由18～25个碱基组成并与靶基因序列配对，3′端序列由6～12个碱基用来引导PCR反应的特异性延伸，这两段独立的特异性区域利用寡聚次黄嘌呤(Inosine，I)进行连接，由于次黄嘌呤比一般碱基的退火温度低，在退火时寡聚次黄嘌呤形成类似泡状的结构，从而使5′和3′区域形两个独立功能的双特异性引物结构，而且由于其特殊的结构，引物自身以及引物之间很少形成二级结构且对退火温度不敏感。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测或辅助检测待测病毒是否为葡萄卷叶伴随病毒3号的DPO引物。

本发明提供的检测或辅助检测待测病毒是否为葡萄卷叶伴随病毒3号的DPO引物由SEQ ID No.1所示的单链DNA分子和SEQ ID No.2所示的单链DNA分子组成。

本发明的另一个目的是提供一种检测或辅助检测待测病毒是否为葡萄卷叶伴随病毒3号的实时荧光PCR试剂。

本发明提供的检测或辅助检测待测病毒是否为葡萄卷叶伴随病毒3号的实时荧光PCR试剂包括上述DPO引物。

上述实时荧光PCR试剂中，所述引物1和所述引物2在所述实时荧光PCR试剂中的终浓度均为0.4μmol/L。

本发明还有一个目的是提供一种检测或辅助检测待测病毒是否为葡萄卷叶伴随病毒3号的试剂盒。