[发明专利]一种天然防腐剂ε-聚赖氨酸菌种及其筛选、发酵和鉴定方法

权利要求书

1.一种天然防腐剂ε-聚赖氨酸菌种，其特征在于，中文命名为分隔北里孢KY3，英文命名为KitasatosporaclausaKY3；该菌种于2014年12月14日保藏于位于中国·武汉·武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号M2014646，CCTCCNO：M2014646。

2.如权利要求1所述天然防腐剂ε-聚赖氨酸菌种的筛选方法，其步骤包括，

（1）选取江西省樟树市郊水稻田或菜地土壤样品，自然风干7天，碾碎，60℃烘2小时；

（2）取1g烘干后土壤样品，加入10mL质量分数为0.85%的盐水中，30℃振荡10分钟，然后静置30分钟，吸取上清液；

（3）将20μL的上清液涂布于含有浓度为130mg/L的K₂Cr₂O₇的初筛培养基上，28-30℃培养5天；

（4）挑选产生透明圈的单菌落，置于斜面培养基上28℃培养3天，通过滴加Dragendorff试剂进行检验，周围能与Dragendorff试剂形成明显砖红色聚集圈的产透明圈菌株，即为ε-聚赖氨酸菌株。

3.如权利要求2所述天然防腐剂ε-聚赖氨酸菌种的筛选方法，其特征在于，步骤（3）中所述初筛培养基的组成为：甘油8-10g、琼脂15-18g、酵母膏0.2-0.4g、NaH₂PO₄0.5-0.8g、MgSO₄?7H₂O0.3-0.5g、(NH₄)₂SO₄0.6-0.8g、120-150mL痕量矿物溶液，定容至1L，用质量浓度0.1%的稀盐酸或氢氧化钠溶液将pH调节为6.5-7.5，并在1×10⁵Pa下121℃灭菌30-50min。

4.如权利要求3所述天然防腐剂ε-聚赖氨酸菌种的筛选方法，其特征在于，所述痕量矿物溶液组成为：NaCl1g、H₃BO₃0.01g、CaCl₂?2H₂O0.1g、NH₄Mo₇O₂₄?4H₂O0.01g，定容至1L。

5.如权利要求2所述天然防腐剂ε-聚赖氨酸菌种的筛选方法，其特征在于，步骤（4）中所述斜面培养基含有初筛培养基和占初筛培养基体积分数为0.002%的美兰。

6.如权利要求1所述天然防腐剂ε-聚赖氨酸菌种的发酵方法，其步骤包括，

（1）在5L自动发酵罐中装入3.5L混合液，混合液中含有800-1000g/L葡萄糖和500-600g/L(NH₄)₂SO₄，按接种量8%（质量分数）取ε-聚赖氨酸菌种；

（2）在5L自动发酵罐中通风量1.0vvm，温度30℃，溶氧（DO）维持在20%，溶氧-转速联动；

（3）初始pH值为6.8，当pH自然下降到3.8时，自动流加10%的氨水维持pH3.8，每隔3-6h取样测量生物量、葡萄糖及ε-PL浓度，至碳源耗尽。

7.如权利要求1所述天然防腐剂ε-聚赖氨酸菌种的鉴定方法，其步骤包括，

1)形态与培养特征：将ε-聚赖氨酸菌种置于在甘油-天门冬琼脂上，30℃培养48h，孢子丝呈波曲状，生成气丝为灰白色，生长致密，在电子显微镜下孢子长椭圆形至椭圆形，大小差别较大；

2)细胞壁化学组分分析：将ε-聚赖氨酸菌种发酵纯化产物的水解液，ε-聚赖氨酸标准品的水解液和赖氨酸标准品进行薄层层析，结果显示ε-聚赖氨酸菌种纯化产物及ε-聚赖氨酸的水解产物和赖氨酸标准品在薄板上仅形成一个斑点，且Rf值相等，因此ε-聚赖氨酸菌种发酵产物为赖氨酸的均聚物；采用Sanger法测定其酰胺键连接方式为ε结构，ε-聚赖氨酸菌种细胞全水解液中含有LLDAP，mesoDAP，糖成分有鼠里糖和葡萄糖；

3)ε-聚赖氨酸菌种16SrDNA全系列的相似性比较和系统发育分析：经PCR扩增、BLAST对比后，发现ε-聚赖氨酸菌种与分隔北里孢菌的16SrDNA序列相似性达到99%，认为是分隔北里孢菌(Kitasatosporaclausa)。