[发明专利]一种以多拉菌素为内标物使用液质联用仪检测羊肌肉组织中伊维菌素残留量的方法

说明书

技术领域

本发明属于兽药残留检测方法领域，特别是涉及到对羊肌肉组织中残留的伊维菌素进行检测的方法。

背景技术

伊维菌素（Ivermectin，简称为IVM）是一种新大环内脂类抗生素，阿维菌素（Avermectins）的第二代衍生物，它与阿维菌素的驱虫机制相同，都是通过加强r—氨基丁酸（GABA）的作用来实现，GABA是一种抑制性神经递质，在大脑GABA主抑制突触后神经传导，GABA的释放量增加，是突触后细胞的正常休止位能提高，神经难以将刺激传递给肌肉，肌肉不能收缩，寄生虫麻痹而被驱除，是阿维菌素家族中最优秀的驱虫药之一，在畜牧业生产中得以广泛的应用。伊维菌素在农牧业广泛用作抗寄生虫剂和杀螨剂，该类药物具有神经和发育毒性，世界卫生组织将其归为高毒化合物。由于脂溶性好、代谢慢，长期大量非合理使用该类药物，会在动物体内造成高残留，从而对人类健康产生巨大的影响。目前，以羊肌肉组织内伊维菌素残留的检测方法为研究对象的相关报道相对较少；国内用于伊维菌素残留检测的方法主要有以高效液相色谱为基础的液相色谱紫外线检测法（HPLC-UV）、液相色谱荧光检测法（HPLC-FLD）与免疫亲和色谱技术(IAC)；酶联免疫(ELISA)等。

现有技术当中的液相色谱法：是使用液相色谱仪进行组分分离，以紫外分光光度计为检测器检测各组分的含量。由于伊维菌素分子结构中具有共轭二烯结构，在245nm波长处有强的紫外吸收，在此光谱区域存在着脂类、皮质激素、维生素、核酸等众多内源性物质，紫外检测器的灵敏度太低，易受杂质干扰，所以高效液相色谱紫外线检测法（HPLC-UV）已无法满足目前农产品中阿维菌素及其有毒代谢物的残留分析要求。

现有技术当中的酶联免疫吸附法：利用抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础，依靠比色来确定药物残留情况的检测方法，目前已有部分特异性的酶联免疫试剂盒投入使用，但是，免疫分析检测具有一定的盲目性，我国市场上酶联免疫法成品试剂盒大多从国外进口，酶联免疫法的应用范围受到较大的限制。

现有技术当中的液相色谱荧光检测法：是利用液相色谱对化合物进行分离，然后利用化合物的紫外或荧光特性进行定性定量鉴定，特别是液相色谱-荧光检测法（HPLC-FLD），具有选择性好、灵敏度高、成本相对较低且易于推广等特点，检出限可达1ppb，但这种检测方法需要进行衍生化，操作复杂，不适合进行大量的实用性检测。

现有技术当中的液相色谱质谱检测法，多采用外标法定量。质谱检测器的检测较灵敏，许多因素会造成检测的不准确性，这些容易引起色谱峰面积不稳定，造成定量不准确等问题。如GB/T21320-2007等，其批内变异系数≤20%批间变异系数≤30%，变异较大。

现伊维菌素残留检测净化技术中，多采用乙腈饱和正己烷的液-液萃取法和C₁₈柱、中性氧化铝柱和碱性氧化铝柱的固相萃取法。乙腈饱和正己烷的液-液萃取法，伊维菌素微溶于正己烷，在去除杂质的同时也会有一定量伊维菌素的损失。GB/T21320-2007则选用了C₁₈和C₈固相萃取柱进行双重净化,操作程序复杂繁琐。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明解决的技术问题为：提供一种用于羊肌肉组织中伊维菌素残留的检测方法，通过对现有前处理技术的优化和细化，获得了良好的富集净化效果，通过加入多拉菌素内标，进行液相色谱-串联质谱法检测，提高了检测方法灵敏度、重复性和准确度，适合大批量样品检测。

本发明实现上述目的所采用的技术方案如下：

一种以多拉菌素为内标物使用液质联用仪检测羊肌肉组织中伊维菌素残留量的方法，包括如下步骤：

步骤一、提取

称取剪碎混匀的新鲜羊肌肉组织2.0g至50mL离心管中，加8mL乙腈，高速匀浆1min，涡旋振荡2min，超声5min，4000r/min离心10min，取上清液；再用8mL乙腈洗涤匀浆刀头,洗涤液涡旋振荡2min，超声5min，4000r/min离心10min，取上清液；合并上清液，得到提取液；

步骤二、固相萃取

向碱性氧化铝固相萃取柱中添加无水硫酸钠2g,先用10ml乙腈过柱活化，再将步骤一中的提取液过柱，保持流速在1～1.5mL/分钟，再用3mL乙腈洗柱，收集全部流出液，氮气吹干；

步骤三、进样

步骤二吹干得到的残渣用1.0mL乙腈溶解,再加入50μL浓度为1μg/mL的多拉菌素内标液，涡旋30s,过0.22μm滤膜后,上液质联用仪进行检测；