[发明专利]石榴果皮中莽草酸和3-脱氢莽草酸的HPLC测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及石榴果皮中莽草酸和3-脱氢莽草酸的HPLC测定方法，属于医药技术领域。

背景技术

石榴(PunicagranatumL.)果实富含可溶性酚类物质、类固醇和生物碱等生物活性物质，具有抗氧化、抗癌抗菌和预防心脑血管疾病等诸多营养价值与保健功能，越来越受到消费者青睐，发展前景广阔。没食子酸是石榴果实中主要的酚类物质之一，生物学效应广泛，与其较强的保健功能密切相关。没食子酸的代谢途径已基本清楚，莽草酸途径生成的3-脱氢莽草酸在莽草酸脱氢酶作用下生成没食子酸。另有报道，莽草酸在莽草酸脱氢酶作用下生成3-脱氢莽草酸，3-脱氢莽草酸烯醇化后在脱氢莽草酸脱氢酶作用下也可生成没食子酸。

莽草酸(Shikimicacid)是抗禽流感药物磷酸奥司米韦(商品名：达菲)和抗肿瘤药物二恶霉素、乙二醛酶抑制剂等的合成原料。3-脱氢莽草酸(3-dehydroshikmiicacid,DHS)是芳香族氨基酸生物合成途径的中间产物，是一种重要的可再生资源，可合成没食子酸、原儿茶酸、香草醛和儿茶酚等重要的化学制剂，也是一种十分有效的抗氧化剂，具有重要的商业价值。对含有莽草酸和3-脱氢莽草酸的植物进行筛选，通过定量检测为莽草酸和3-脱氢莽草酸提取原料的确定建立科学的依据，具有现实的意义和积极作用。石榴果实中富含没食子酸，也应含有莽草酸和3-脱氢莽草酸，为明确石榴果实中没食子酸的代谢机理，建立一种快速、准确、同时测定莽草酸和3-脱氢莽草酸含量的方法十分必要。

目前，对莽草酸含量测定的方法主要是高效液相色谱法，仅在松柏科植物、八角茴香等植物上有少量报道，但3-脱氢莽草酸含量测定的方法国内外至今未见相关报道。因此，有必要建立一种科学的、适于测定石榴果实中莽草酸和3-脱氢莽草酸的方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种石榴果皮中莽草酸和3-脱氢莽草酸的HPLC测定方法。本发明方法可同时测定石榴果皮中莽草酸和3-脱氢莽草酸的含量，针对性地检测石榴果实中的莽草酸和3-脱氢莽草酸成分，为揭示石榴果实中没食子酸的代谢机理奠定了理论基础。

本发明的技术方案如下：

石榴果皮中莽草酸和3-脱氢莽草酸的HPLC测定方法，包括如下步骤：

(1)石榴果实样品的前处理

将石榴果实洗净擦干，把果皮削到液氮中冷冻5～10min，之后捞出至培养皿中，于-20℃冰箱冷冻24～36h后，再放入冷冻干燥机中冷冻干燥36～48h；经冷冻干燥后的果皮粉碎后放入-20℃冰箱中备用；

(2)供试品溶液的制备

称取步骤(1)处理好的果皮0.1g，置具塞锥形瓶中，加超纯水40mL，超声处理90-120min，过滤，定容至50mL，以0.22μm微孔滤膜过滤，放入-20℃冰箱中保存，用于HPLC测定；

(3)莽草酸和3-脱氢莽草酸的含量测定

高效液相色谱实验条件如下：安捷伦ZorbaxXDB-C18色谱柱，长×宽＝150mm×4.6mm，厚度为5μm，以甲醇为流动相A，体积百分比1％磷酸水溶液为流动相B，等度洗脱，流动相比例为：A：B＝5：95体积比，洗脱时间：10-15min，紫外检测器检测波长为200～260nm，流速为0.8-1ml/min，柱温为30℃，样品进样量10μl；

莽草酸和3-脱氢莽草酸含量测定方法如下：取莽草酸和3-脱氢莽草酸标准品，分别配成每1ml含0.25mg、0.50mg、0.75mg、1.00mg、1.25mg、1.50mg、1.75mg、2.00mg的标准品溶液，二者混合后即为标准品混合液；

高效液相色谱测定：在以上确定的色谱条件下，上述不同浓度的标准品混合液分别以10μl进样，测定莽草酸和3-脱氢莽草酸标准品溶液的高效液相色谱峰面积；以所得各标准品峰面积为纵坐标，对应的标准品浓度为纵坐标做标准曲线，分别计算得线性回归方程；然后对10个石榴品种供试品溶液进行高效液相色谱测定，得到莽草酸和3-脱氢莽草酸的峰面积，根据标准曲线计算供试品中二者的含量，即得。

根据本发明优选的，所述步骤(1)石榴果实样品的前处理中，果皮直接削到液氮中冷冻5min，防止组织褐变，之后再捞出至培养皿中。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中紫外检测波长为214nm。

进一步优选的，石榴果皮中莽草酸和3-脱氢莽草酸的HPLC测定方法，包括如下步骤：

(1)石榴果实样品的前处理