[发明专利]一种亚麻悬浮细胞诱变育种的方法

说明书

技术领域

一种亚麻悬浮细胞诱变育种的方法，是细胞工程在植物育种领域中的应用技术，涉及植物细胞工程育种技术领域。

背景技术

植物育种技术被应用于农作物品种改良、中草药材有效成分提高、林果品种改良、观赏花草育种、经济植物如芳香植物及抗菌植物等方面的育种生产中。目前应用最广的是杂交育种技术，该技术十分成熟，历史悠久。随着生命科学与技术的发展与进步，基因育种、细胞工程育种、太空育种等技术也从实验室研究逐步走向实际应用，并取得了传统育种技术难以实现的育种效果，具有良好的发展前景。

发明内容

一种亚麻悬浮细胞诱变育种的方法，是采用悬浮的亚麻胚性单细胞和小细胞团作为诱变对象，用EMS、紫外线、离子束类物理、化学等诱变剂作用于它们，诱导其发生突变，然后在特殊设定胁迫环境下筛选发生特性突变的细胞或细胞团，再经细胞培养技术，获得突变的胚性细胞系，经再分化成苗，试管苗经扩繁培育成具有特殊性状的亚麻种质。

该技术鉴于悬浮细胞多为单细胞起源，受胁迫的选择压力均一，易获得较高的定向突变细胞系，且能大大减少嵌合体的形成，是直接获得同质突变体的理想技术方法；

具体技术方案如下。

1、亚麻种子萌发

选择饱满、完整、大小均匀的亚麻种子，用10%（过氧化氢）H₂O₂振摇浸泡种子10min，用无菌长勺将种子捞出，不经冲洗直接接入无激素的MS基本固体培养基上，在培养温度为21±3℃、光照周期为14h光/d、光照强度为1500-2500Lux的条件（下述的培养条件相同）下培养7-8天，种子萌发成2-4cm高的无菌苗。

2、建立纤维亚麻胚性细胞悬浮系

以亚麻无菌苗的下胚轴段（1—1.5cm长）为材，在1号固体培养基[MB（NH₄NO₃减半而KNO₃加倍的MS）+0.5mg/LBA+0.5mg/LNAA+3%蔗糖+0.7%琼脂]上培养30—45天，得到愈伤细胞团。转入2号固体培养基[MB+0.5mg/LBA+0.5mg/LKT+3%蔗糖+0.7%琼脂]上培养30天，得到浅黄色结构较松散的愈伤细胞团。

将细胞团转入3号液体培养基[MB+0.2mg/LBA+5%蔗糖]中，900rpm摇床上暗培养，每隔6天换培养基一次，4次换液后，在净化工作台上挑弃肉眼可见的细胞团，采用滴片镜检，保留细胞形状较均匀，多球形，分裂旺盛，内含物丰富的培养物。再换4次液后，调整细胞密度为1.2—1.5g鲜重/25ml，再培养12天后得到胚性细胞系。

3、诱变

在净化台上将胚性细胞移入无菌的离心管，加盖，1000rpm，离心1min，吸弃上清，用含0.1%（甲基磺酸乙酯）EMS的3号培养基悬浮，倒入广口培养瓶，在900rpm摇床上处理6h，然后转入无菌离心管，1000rpm离心1min，吸弃上清，同法洗3次，收集细胞。

4、特定环境下胁迫

4.1例如用含150mmol/L（氯化钠）NaCl的3号培养基悬浮细胞，倒入广口培养瓶，封口后在900rpm摇床上暗培养12h，无菌条件下将细胞悬液倒入离心管，封口，1000rpm离心1min，吸弃上清，用正常3号培养基悬浮细胞，移入广口培养瓶，封口，在900rpm摇床上培养6天，在净化台上静置，吸弃培养液。

4.2例如用含10mmol/L（碳酸氢钠）NaHCO₃的3号培养基悬浮细胞，倒入广口培养瓶，封口后在900rpm摇床上暗培养12h，无菌条件下将细胞悬液倒入离心管，封口，1000rpm离心1min，吸弃上清，用正常3号培养基悬浮细胞，移入广口培养瓶，封口，在900rpm摇床上培养6天，在净化台上静置，吸弃培养液。

4.3例如用含24.5mmol/L（聚乙二醇）PEG（渗透压相当于添加100mmol/LNaCl）的3号培养基悬浮细胞，倒入广口培养瓶，封口后在900rpm摇床上暗培养12h，无菌条件下将细胞悬液倒入离心管，封口，1000rpm离心1min，吸弃上清，用正常3号培养基悬浮细胞，移入广口培养瓶，封口，在900rpm摇床上培养6天，在净化台上静置，吸弃培养液。

5、筛选

无菌条件下用无菌长勺将细胞移至盛有4号培养基[MB+0.02mg/L2.4-D+0.2mg/LBA+5%蔗糖+0.7%琼脂]的培养瓶中，在其表面均匀地铺一薄层，封口，在1200—1500Lux光强度，10h光/14h暗的光周期，220C±20C的条件下培养1个月。