[发明专利]一种稻属12个物种的基因组BAC同源区筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域的基因组BAC（细菌人工染色体）同源区筛选方法，特别涉及一种通过特殊设计的方案进行两轮southern杂交来筛选基因组BAC同源区的方法。

背景技术

对包含二倍体、四倍体等不同基因组类型在内的亲缘关系较近的多个植物物种开展基因组比较研究是了解植物基因与基因组发展、进化的有力手段。多个物种整个基因组的比较能对所分析物种得出比较全面的认识，但因全基因组信息量的巨大使得对比较重要的某些基因位点分析欠详细。农业生产上包含水稻、小麦在内的绿色革命都是由于少数几个关键基因的利用而引发的，如由于水稻、小麦资源中少数几个矮秆基因的开发利用而引发了第一次“绿色革命”；野生稻资源中“野败”的发现与应用对我国的杂交水稻取得巨大的成功起着关键的作用。但是，小麦-黑麦1BL/1RS易位系的利用历史表明，虽然1RS上抗三种锈病基因（Yr9、Lr26、Sr31）及抗白粉病基因（Pm8）使普通小麦的抗病性得到了很好的遗传改良，但1RS上所携带的不良基因使易位系小麦的加工品质变劣，面团耐揉性减弱、面团发黏等问题。如何搞清重要性状基因区基因组成？是否有不利基因连锁？是否存在重要性状基因的保守调控位点？等等，这些问题的解决需要开展近缘物种间重要功能基因所在同源区的比较研究。

基因组BAC文库是进行基因组BAC同源区研究的必要资源。迄今为止，众多生物中已经构建了大量的基因组BAC文库。分蘖是水稻、小麦等禾本科作物所具有的一个重要农艺性状，与创建理想株型密切相关，因而广受世界各国广泛关注。BAC文库筛选可以有PCR法、southern杂交法等多种方法。粳稻日本晴中分蘖控制基因（MOC1）已被成功克隆。针对MOC1及其所在BAC同源区采用特殊设计的方案进行两轮southern杂交方法来筛选MOC1所在稻属12个物种的同源区BAC，目前尚未见有专门报道。本发明所介绍的方法解决了如何从12个栽培稻的近缘物种的基因组BAC文库中快速有效的进行同源序列区尽可能长的基因组BAC筛选问题。

发明内容

本发明通过特殊设计的方案采用两轮southern杂交的方法实现了MOC1所在稻属12个物种的同源区BAC的筛选。

1野生稻基因组BAC文库的第一轮筛选。

本发明所用的BAC文库涵盖了稻属12个物种、10种不同的基因组类型（AA、BB、CC、EE、FF、GG、BBCC、CCDD、HHJJ、HHKK）（见表2）。

1.1关于“锚定探针”。

本发明“锚定探针”即MOC1，为单外显子基因（图1A），水稻基因组只有单拷贝，位于水稻6号染色体的长臂上（图1E），属于GRAS转录因子基因家族（图1D）一员。从蛋白结构上看，该基因家族在N端富于变化而C端很保守。为保证southern杂交的特异性本发明特在MOC1编码区的5’端即蛋白质多肽链的N端设计引物（引物序列见表1）进行探针片段的扩增（图1A）。扩增（图1B）及测序结果（图1C）表明MOC1探针制备良好。

1.2野生稻基因组BAC文库第一轮筛选结果。

用“锚定探针”MOC1以Southern杂交的方法对野生稻基因组BAC文库进行初步筛选，共筛选到195个阳性BAC克隆（表2）。其中筛选到阳性BAC克隆最多的是HHKK基因组型的O.coarctata，筛选到22个，最少的是BB基因组型的O.punctata，只筛选到8个。这是符合预期结果的，异源四倍体基因组因含有2个MOC1位点，故应筛选到较二倍体多约1倍的阳性BAC克隆。值得注意的是，同是二倍体基因组如CC和BB，筛选到的阳性BAC克隆数目相差1倍（前者16个，后者8个），这暗示该2个二倍体基因组在MOC1同源区HindⅢ的酶切位点存在较大差异，前者（CC组）应该比后者（BB组）存在更多的HindⅢ酶切位点。

表1用于BAC克隆筛选的探针引物序列。

[0013]表2MOC1探针从野生稻BAC文库中筛选到的阳性克隆。

2对第一轮筛选出的阳性BAC的第二轮筛选。