[发明专利]一株苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫学检测领域。

背景技术

苯噻氰（TCMTB）是一种十分经济、有效的绿色杀菌剂，它与美国Buckmam公司的BUSAN30L，法国Progiven公司的BIOCIDE MT30均属同一类产品，它能有效地应用于种子处理，对存在的主要细菌、真菌和藻类都有极强的灭杀和控制作用，对于种子拌种、浸种和喷雾治疗炭疽、稻瘟、猝倒、立枯和柑橘溃疡等病害有特效，因此，苯噻氰及其代谢产物在植物与土壤都有较大的残留。

目前检测苯噻氰的方法主要有气相色谱法（GC），液相色谱法（HPLC），分光光度法、电化学测定法、气质联用法等方法。但是这些方法存在操作繁琐，耗时，费用比较贵等缺点，不能实现大量样品的快速检测，因此建立一种快速简便的苯噻氰检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。然而得到高特异性和高灵敏度的单克隆单体是免疫学检测的前提，其中人工抗原的合成是其中重要的一步。

发明内容

本发明的目的是提供一株苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对苯噻氰具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立苯噻氰的免疫学检测方法。

本发明的技术方案，一株苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株，其命名为1B2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 10862。

所述苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株1B2的制备，步骤为：

1）完全抗原的合成：

A液的制备：称取28.6mg TCMTB类似物2-苯并噻唑硫代乙酸BTAC，EDC（碳二亚胺）38.3mg，NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）23.0mg，用1mL无水DMF溶解，称为A液，室温搅拌反应8h；

B液的制备：称取BSA（牛血清蛋白） 112mg溶于20mL pH7.4的0.01mol/L PBS中，得到B液；

在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，得到偶联物BTAC-BSA混合液即为苯噻氰完全抗原，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；

2）小鼠的免疫：

苯噻氰完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂；首免与加强免之间间隔一个月，加强免3次，加强免之间间隔21天；最后用苯噻氰完全抗原，不含佐剂，冲击免疫；通过间接ELISA检测血清效价和抑制；

3）细胞融合与细胞株建立：

通过聚乙二醇PEG 4000法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株1B2；

4）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ELISA法测定灵敏度和特异性。

通过苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株1B2分泌产生苯噻氰单克隆抗体。

将苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株1B2通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于食品接触相关材料中苯噻氰的快速检测，具体步骤如下：

（1）包被：将包被原TCMTB-OVA用0.05M pH 9.6 碳酸盐缓冲液从2µg/mL开始倍比稀释，100µL/孔，37℃反应2h；

（2）洗涤：将酶标板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；

（3）封闭：拍干后，加入200µL/孔封闭液，37℃反应2h；洗涤后烘干备用；

（4）加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100µL/孔，37℃反应1h；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100µL/孔，37℃反应1h；

（5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100µL的TMB显色液，37℃避光反应15min；

（6）终止和测定：每孔加入50µL 2M H₂SO₄终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD₄₅₀值；

（7）结果判读：以OD₄₅₀值大于或等于阴性对照孔的2.1倍，即P/N≥2.1，所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价；