[发明专利]对水产养殖环境沉积物中反硝化微生物的定量方法

权利要求书

1.一种利用实时荧光定量PCR(qPCR)对水产养殖环境中反硝化微生物进行定量的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)宏基因组DNA提取：使用土壤DNA快速提取试剂盒，在核酸提取仪上对水产养殖环境沉积物样品DNA进行提取。

(2)选取引物：根据水产养殖环境的特点，在现有特异性引物对中选取nirK基因引物F1aCu/R3Cu和nirS基因引物cd3aF/R3cd用于目的基因和荧光定量PCR的扩增。

(3)标准质粒的构建：

①目的基因nirK和nirS的扩增：使用步骤(2)中选取的引物，以步骤(1)中的宏基因组DNA为模板进行PCR扩增，分别得到nirK和nirS基因片段；

②目的基因纯化产物的获得：将步骤(3)①中目的基因使用凝胶回收试剂盒进行纯化；

③标准质粒的获得：将步骤(3)②中得到的目的基因nirK和nirS片段纯化产物与T载体连接，热激法转入到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，筛选鉴定，获得含有目的基因nirK和nirS的标准质粒，并进行序列测定。

④标准质粒线性化：提取标准质粒DNA，并用限制性内切酶NdeI酶切过夜，使质粒线性化。然后在Modulus多功能光度计上检测质粒浓度。测得浓度的标准质粒进行10倍梯度稀释，制作浓度梯度标准品。

⑤标准质粒分子量的计算：根据测序结果计算标准质粒的分子量，并按照以下公式计算含有目的基因的标准质粒的拷贝数：C＝6.02×10²³×C₀/M(其中C为拷贝数，C₀为质粒浓度，M为含有目的基因质粒的分子量)。

(4)nirK和nirS基因qPCR扩增

①qPCR扩增：将步骤1(1)中的宏基因组DNA样品测定浓度并统一调整浓度为10μg/μl，与步骤1(3)④中的浓度梯度质粒标准品DNA同时进行qPCR扩增，每个样品至少三个平行。

②标准曲线的制作：以不同浓度质粒拷贝数的对数为横坐标，对应的Ct值为纵坐标绘制标准曲线。

③反硝化微生物nirK和nirS基因拷贝数的计算：根据步骤(4)②中的标准曲线和样品Ct值计算样品中反硝化微生物nirK和nirS基因的拷贝数，计算养殖环境中反硝化微生物的数量。

2.根据权利要求1所述的使用实时荧光定量PCR技术检测养殖环境中反硝化微生物数量的方法，其特征在于：同时使用两种亚硝酸盐还原酶功能基因nirK和nirS作为分子标记检测反硝化微生物的数量。

3.根据权利要求1所述的使用实时荧光定量PCR技术检测养殖环境中反硝化微生物数量的方法，其特征在于：

步骤(3)①中所述的PCR反应条件分别为，nirK基因：95℃5min；95℃1min，58℃1min，72℃1min，共35个循环；最后72℃10min；nirS基因：94℃5min；94℃1min，57℃1min，72℃1min，35个循环；最后72℃10min。

所述的nirK和nirS基因PCR反应体系为：10×PCRBuffer1.25μl，25mMMgCl₂0.75μl，2.5mMdNTP1.00μl，1μg/μlBSA1.00μl，10μM引物各0.25μl，模板DNA1.00μl，TaqDNA聚合酶2.5U，ddH₂O补充到12.5μl。

4.根据权利要求1所述的使用实时荧光定量PCR技术检测养殖环境中反硝化微生物数量的方法，其特征在于：

步骤(3)③中所述的质粒载体为T载体；

步骤(3)③中所述的感受态细胞为大肠杆菌DH5α感受态细胞；

步骤(3)③中所述的筛选鉴定根据质粒载体选择氨苄青霉素对菌落进行初筛，再通测序确定所选的标准质粒。

步骤(3)④中所述的对标准质粒进行线性化，选用的限制性内切酶为NdeI。