[发明专利]富集T‑2毒素的免疫磁珠及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种富集T-2毒素的免疫磁珠的制备方法，其是以粒径2.8μm的羧基磁珠为载体，羧基磁珠末端具有反应活性的羧基基团，在经活化剂EDC-NHS组合处理后，活化磁珠与T-2毒素单克隆抗体进行偶联，制备成能够富集净化T-2毒素的免疫磁珠，其特征在于：所述T-2毒素单克隆抗体是用T-2毒素人工抗原免疫白鼠所得到的，所述T-2毒素人工抗原是T-2毒素半抗原与载体蛋白的偶联物，所述T-2毒素半抗原是按照如下方法制备得到的：

Ⅰ、将100mg T-2毒素加乙腈溶解，再加入200μL乙酸和200mg重铬酸吡啶盐，70℃反应4h，停止反应，旋蒸，除去乙腈，加水-乙酸乙酯萃取，干燥，蒸干，上硅胶柱，用三氯甲烷/甲醇＝10:1洗脱分离，得到中间产物；

Ⅱ、将中间产物加3mL乙醇溶解后，再加入50mg碳酸钾和5mL含有200mg氨基丙酸的水溶液，60℃反应12h，停止反应，加水-乙酸乙酯萃取，除去有机相，水相加稀盐酸调节pH到4，加乙酸乙酯萃取，除去水相，有机相干燥蒸干，乙醚重结晶，得到T-2毒素半抗原，其分子结构式为：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述T-2毒素人工抗原是按照如下方法制备得到的：将12mg T-2毒素半抗原溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺中，将30mg二环己基碳二亚胺和30mg N-羟基琥珀酰亚胺溶于0.2mL N,N-二甲基甲酰胺后加入半抗原溶液中，室温搅拌24h，称为A液；将50mg载体蛋白溶于3.8mL pH 7.2的PBS缓冲液中，称为B液；将A液加入到B液中，室温搅拌24h，离心取上清液，将得到的产物透析，得到所述T-2毒素人工抗原，其分子结构式为：

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：

(1)清洗：取100μL羧基磁珠于离心管中，用100μL含0.05％吐温-20的pH5.0、25mmol/L的MES溶液洗涤2次，磁分离后移除上清；

(2)活化：用4℃贮存的pH5.0、25mmol/L MES溶液分别配制50mmol/L的EDC、NHS溶液；分别加入50μL新配制的EDC和NHS溶液到装有磁珠的离心管中，涡旋混匀，室温活化30min，磁分离后移除上清，同(1)MES溶液洗涤2-3次；

(3)偶联：将T-2毒素单克隆抗体溶解到60μL pH5.0、25mmol/L MES溶液中，用所述MES溶液调节总体积至100μL，轻柔加入到已活化磁珠中，室温偶联30min或4℃偶联2h，期间使磁珠保持混匀状态；

(4)封闭：磁分离后移除上清，加入100μL含50mmol/L乙醇胺的pH8.0的PBS溶液反应15min封闭磁珠；

(5)保存：磁分离后移除上清，用100μL含0.1％-0.3％牛血清白蛋白、0.1％吐温-20的PBS溶液洗涤封闭好的磁珠3-5次，磁分离后移除上清，将磁珠复溶于含0.1％-0.5％牛血清白蛋白、0.01％-0.1％吐温-20、0.02％NaN₃的PBS溶液中，2-8℃保存备用。