[发明专利]一种固定化糖苷酶试剂及其制备方法

权利要求书

1.一种固定化糖苷酶试剂，包括温敏性磁流体载体材料和糖苷酶，其特征在于，所述糖苷酶固定在温敏性磁流体载体材料上，所述温敏性磁流体材料的原料包括温敏性单体、具有能与糖苷酶结合活性官能团的单体和带有表面引发原子转移自由基聚合的引发剂的磁性纳米颗粒，所述温敏性单体和具有能与糖苷酶结合活性官能团的单体共聚合成聚合物链，共聚合而成的聚合物链与所述磁性纳米颗粒通过配位键连接；聚合物链与所述糖苷酶通过碳氮键连接。

2.根据权利要求1所述的固定化糖苷酶试剂，其特征在于，所述带有表面引发原子转移自由基聚合的引发剂的磁性纳米颗粒是将表面引发原子转移自由基聚合的引发剂固定连接在所述磁性纳米颗粒的表面而成；所述表面引发原子转移自由基聚合的引发剂的一端是与铁原子发生配位作用的偶联剂，另一端是原子转移自由基聚合的引发剂。

3.根据权利要求1所述的固定化糖苷酶试剂，其特征在于，所述温敏性单体为丙烯酰胺类单体，具体为N-异丙基丙烯酰胺；所述具有能与糖苷酶结合活性官能团的单体为具有烯醛类单体，具体为十一烯醛；所述糖苷酶为肽N-糖苷酶F。

4.根据权利要求2所述的固定化糖苷酶试剂，其特征在于，所述偶联剂为硅烷偶联剂。

5.根据权利要求2所述的固定化糖苷酶试剂，其特征在于，所述硅烷偶联剂具体为3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷或γ-巯丙基三乙氧基硅烷。

6.根据权利要求1所述的固定化糖苷酶试剂，其特征在于，所述表面引发原子转移自由基聚合的引发剂为2-溴异丁酰溴、α-溴代异戊酰溴或α-溴丙酰溴；所述硅烷偶联剂与所述原子转移自由基聚合的引发剂由酰胺键连接。

7.根据权利要求1所述的固定化糖苷酶试剂，其特征在于，所述固定化糖苷酶试剂生产酶解液体的方法如下：在待酶解的糖蛋白中加入DTT，37℃水浴中还原，再加入IAA于暗处放置进行烷基化从而进行变性，得到变性的待酶解糖蛋白；将所述固定化酶与变性的待酶解糖蛋白在H=8.025-100mM碳酸氢铵溶液或pH=7.825-100mM的磷酸盐缓冲液中混合均匀，超声振荡，加热磁性分离，得酶解液。

8.一种如权利要求1-7任一所述的固定化糖苷酶试剂的制备方法，其特征在于，具体步骤如下:

（1）表面引发原子转移自由基聚合的引发剂的制备方法：将硅烷偶联剂和质子酸捕捉剂于冰浴中进行反应，再加入原子转移自由基聚合的引发剂，进行反应，即得，其中硅烷偶联剂、原子转移自由基聚合的引发剂和质子酸捕捉剂的投料摩尔比为0.5-1：1：1；

（2）带有表面引发原子转移自由基聚合的引发剂的磁性纳米颗粒的制备方法：将所述磁性纳米颗粒进行油酸包裹修饰，将其与表面引发原子转移自由基聚合的引发剂于溶剂中混匀发生配体交换反应生成配位键，即得，所述溶剂为苯或甲苯正己烷，所述配体交换反应的温度为20-30℃，配体交换反应的时间为1-72h；述磁性纳米颗粒与所述表面引发原子转移自由基聚合的引发剂的质量比为1：0.45-5.45；

（3）温敏性磁流体载体材料的制备方法：将温敏性单体、活性功能单体、催化剂、配体和溶剂混合，得到混合液A，将混合液A与所述带有表面引发原子转移自由基聚合的引发剂的磁性纳米颗粒混合，得混合液B，除去混合液B中的氧气，引发原子转移自由基共聚合反应，即得；所述催化剂为如下任意一种金属的卤化物：Cu、Mo、Ru、Rh、Fe、Re、Ni、Pd和Pb；所述配体为N，N，N'，N''，N''-五甲基二乙烯基三胺、2，2'-联吡啶、四甲基乙二胺、1，1，4，7，10，10-六甲基三亚乙基四胺或三(2-二甲氨基乙基)胺；所述溶剂为甲醇、乙醇、环己醇、异丙醇、二甲基亚砜或四氢呋喃；所述温敏性单体、活性功能单体、催化剂、配体的摩尔比为200:100-1:0.5-5:0.75-7.5；

（4）将所得温敏性磁流体载体材料与糖苷酶混合，首先将糖苷酶溶于pH为7.4的磷酸盐缓冲液中，加入氰基硼氢化钠得混合液，将混合液加入到所述温敏性载体材料中，反应，加热引起温敏性载体材料的温度响应，磁性分离，进行糖苷酶的固定，引起温敏性载体材料温度响应的温度为18-40℃，所述糖苷酶与所述温敏性载体材料的质量比为1：10-10：1；

（5）将固定了糖苷酶的温敏性磁流体载体材料上剩余的功能基团封闭，得到目的固定化糖苷酶，所述封闭的方法为用氨基乙醇的磷酸盐缓冲液与步骤（1）得到的固定了糖苷酶的功能化载体混合，反应即得；所述氨基乙醇在氨基乙醇的磷酸盐缓冲液中的体积百分含量为5%-20%，所述功能基团为能与所述糖苷酶结合的基团，具体为醛基，所述功能基团位于所述温敏性载体材料的聚合物链上。