[发明专利]一种用次血红素六肽测定血清总胆固醇方法

说明书

技术领域

本发明属于生物、医学技术领域，涉及一种与生物、医学检测方法的改进。

背景技术：

胆固醇，别名胆甾醇，是一种环戊烷多氢菲的衍生物，化学式为C₂₇H₄₆O。

胆固醇广泛存在于动物体内，尤以脑及神经组织中最为丰富，在肾、脾、皮肤、肝和胆汁中含量也高。胆固醇是动物组织细胞所不可缺少的重要物质，它不仅参与形成细胞膜，而且是合成胆汁酸，维生素D以及甾体激素的原料。

胆固醇在血液中存在于脂蛋白中，其存在形式包括高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、极低密度脂蛋白胆固醇几种。血液中总胆固醇浓度的参考范围为2.9～5.2mmol/L，当血液中总胆固醇浓度高于参考范围时，易引发人心、脑血管疾病。因此，总胆固醇测定在疾病诊断中是一种常规检验项目。

总胆固醇的测定方法目前已超过200种，可分为化学试剂比色法、酶分析法、荧光法、气相和高效液相色谱法等五大类。由于气相和高效液相色谱法条件高，临床实验室最常用的是化学试剂法和酶分析法。化学试剂法由于存在操作复杂、试剂有强腐蚀性（浓硫酸）和不易自动化的缺点，现在已很少应用。目前血清中总胆固醇的酶法测定是依据国家标准WS/T120-1999进行的，其原理：

血清(浆)中总胆固醇（TC）包括游离胆固醇(FC)和胆固醇酯（CE）两部分。血清中CE可被胆固醇酯酶（CEH）水解为FC和游离脂肪酸（FFA）。FC在胆固醇氧化酶(CHOD)的作用下生成△4-胆甾烯酮和过氧化氢(H₂O₂)，H₂O₂在4-氨基安替比林(4AAP)和3，5-二氯-2羟基苯磺酸钠（DHBS）存在时，经过氧化物酶(POD)催化，反应生成最大吸收波长在520nm的亚醌胺的红色化合物，其吸光度值与标本中TC含量成正比。该法具有操作简单、试剂无腐蚀性和可全自动操作的特点，是目前大多临床实验室应用的测定方法。

在酶法测定总胆固醇的试剂中，过氧化物酶(POD)是色源产生的关键物质。

POD是一类从植物、动物、微生物中提取出来的氧化还原酶。在生命活动过程中，其主要是催化分解生物体内的氧化物或过氧化物以及氧化分解其它毒素。由于POD是蛋白质，可在储存、运输、应用等环节导致酶的活性下降，进而影响总胆固醇的测定准确性。

发明内容

本发明的目的是：提供一种用次血红素六肽测定血清总胆固醇方法，它利用三价铁卟啉DhHP-6具有过氧化物酶功能的原理，替代过氧化物酶，制备一种总胆固醇检测试剂，建立一种对液体样品中总胆固醇进行定量测定的检测方法。通过检测反应后光吸光度的变化，计算出待测液体样品中总胆固醇的量。本发明的测定方法是：

在自然界中各种POD虽然具有共同的生物活性，但并不具有相同或相似的结构和作用机理。其中含金属卟啉环的血红素过氧化物酶（HPX）是一类结构相似，功能相同的酶类，属于血红素PX蛋白超家族成员。以血红素为辅基的过氧化物酶的结构，设计合成一个具有过氧化物酶活性的模拟物，命名为：次血红素六肽（DeuteroheminAlaHisThrValGluLys，DhHP-6）。

DhHP-6分子量1228.48，分子式是C₅₉H₇₄FeN_13O13，是一种小分子化合物，化学性质非常稳定，在储存、运输、应用等环节无活性下降，而且价格低廉。

a、检测步骤

在全自动生化分析仪520nm波长处测定反应前后吸光度值的变化（△A），通过与同样测定的胆固醇标准品比对，计算出总胆固醇的量。

胆固醇的量（mmol/L）=△A_样本/△A_标准×标准品浓度。

b、试剂组成

①磷酸盐缓冲液，离子强度300mmol/L,pH7.7。

②胆固醇酯酶（Cholesterolesterase,CEH;EC3.1.1.13）

③胆固醇氧化酶（Cholesteroloxidase,CHOD;EC1.1.3.6）

④DhHP-6

⑤TritonX-100

⑥胆酸钠

⑦4-氨基安替比林(4-AAP)

⑧3,5-二氯-2羟基苯磺酸钠(DHBS)

在磷酸盐缓冲液中分别加入以上物品，溶解后2～8℃保存备用。

C、操作过程