[发明专利]一种棘腹蛙感染金黄色葡萄球菌的PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术和生物医学领域，特别涉及一种棘腹蛙的金黄色葡萄球菌的PCR检测试剂及检测方法，适用于感染金黄色葡萄球菌的棘腹蛙的检测。

背景技术

棘腹蛙是一种营养丰富且具药用价值的大型山区食用蛙，其鲜肉干样中蛋白质含量为16.25％、脂肪含量为1.26％，具有丰富的滋补功效和药用价值，随着人民生活水平的不断提高，棘腹蛙的食用价值也在逐渐上升，具有较好的开发前景。同时作为脊椎动物进化中的过渡动物，是进行解剖学、遗传学和胚胎发育学研究较为理想的实验动物。由于环境污染严重、野生栖息地遭受破坏、人类大肆捕杀等因素造成棘腹蛙野生种群数量大量减少；为保护其野生资源，同时满足市场需求，棘腹蛙的人工养殖逐渐受到重视。但是，随着养殖数量的不断增多，随之而来的多种病害对棘腹蛙养殖产业的发展产生严重威胁。感染蛙类的病原菌主要有温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、链球菌等，可见棘腹蛙细菌性疾病是人工养殖过程中常见且危害极大的一类疾病，对细菌性疾病的研究也是棘腹蛙人工养殖的一个重点。目前还没有过棘腹蛙感染金黄色葡萄球菌的报道。

葡萄球菌根据生化反应和产生色素的不同可分为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌三种，其中金黄色葡萄球菌致病力较强，是动物化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。从而给动物水产养殖带来了巨大伤害。近年来，虽然中国特种经济动物养殖业得到了迅猛发展，但由于养殖户的管理水平、养殖场的硬件和软件设施不能进行规范化管理等原因，已经有多起由该菌引起的人畜感染的报道，且已日益被关注。为了及早发现棘腹蛙是否被金黄色葡萄球菌感染，有必要建立一种快速、准确、灵敏的检测方法。

传统病原菌的诊断需要进行显微镜观察，缺乏进行快速、准确、敏感的检测方法。

CN104726594A公开了一种检测金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，采用的引物有：

上游引物：5’-AACAAGATCGCTATGGTAGAACATTGGC-3’nuc

下游引物：5’-CTTCTCTCTAGCAAGTCCCTTTTCCACTA-3’hlyA

上游引物：5’-AAAAGCAAGTTAGCTCATTTCACATCGT-3’hlyA

下游引物：5’-TTACCGTTCTCCACCATTCCCAAG-3’invA

上游引物：5’-CAATCAGTCCTAACGACGACCCTTC-3’invA

下游引物：5’-GCCGCCAAACCTAAAACCAGC-3’tlh

上游引物：5’-CGAACGAGAACGCAGACATTACG-3’tlh

下游引物：5’-CGGGTTAGGGAAGCGCCATT-3’ipaH

上游引物：5’-GGTAAATCTGCTGTTCAGTCTCACGC-3’ipaH下游引物：5’-TTTACGGACTGGTTCTCCCTCTGG-3’。

本发明发现采用上述引物的PCR试剂盒检测棘腹蛙感染金黄色葡萄球菌不敏感，缺乏特异性。为此有必要寻找一种操作简单、特异、快速、敏感等优点的检测棘腹蛙感染金黄色葡萄球菌的PCR检测试剂盒。

发明内容

本发明提供了一种检测棘腹蛙感染金黄色葡萄球菌的PCR检测试剂盒及其检测方法。该检测试剂盒及检测方法能快速、高效、特异性的用于棘腹蛙感染金黄色葡萄球菌的检测。

本发明的一种检测棘腹蛙的金黄色葡萄球菌的PCR检测试剂盒，包含2倍反应混合缓冲液、上游引物、下游引物、Taq酶和灭菌的ddH₂O，其特征在于所述上游引物为S-F：5’–AGGTAACGGCGTAAATAG–3’，所述下游引物S-R：5’–ACTTGCTTCAGGACCATA–3’。

上述本发明的检测试剂盒，所述2倍反应混合缓冲液包含以下成份：

所述2倍反应混合缓冲液的量为1.0ml。

上述本发明的检测试剂盒，所述上游引物和下游引物的浓度均为10μM/L；所述Taq酶为5U/μLTaq酶，其量为0.5μL；所述灭菌的ddH₂O为1.0mL。

上述本发明的检测试剂盒，还包含阳性对照液和阴性对照液，所述阳性对照液为感染金黄色葡萄球菌的棘腹蛙的基因组DNA，所述阴性对照液为ddH₂O。

本发明还提供了一种采用本发明的检测试剂盒检棘腹蛙感染金黄色葡萄球菌的方法，包含以下步骤：