[发明专利]一种脂肪酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及好食脉孢霉液体发酵制备脂肪酶的方法和纯化方法。

背景技术

脂肪酶（Lipase，EC3.1.1.3）又称为三酰基甘油酯水解酶，可以催化三酰甘油酯及其它一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外，还表现出如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等。脂肪酶催化反应具有立体选择性、底物专一性、副反应少、反应条件温和、不需辅酶及可用于有机溶剂等特点，在食品、皮革、生物柴油、医疗医药和洗涤剂等多个生产领域都有应用。

国内外市场的脂肪酶酶制剂种类主要有Novozyme435Lipase、LipaseTLIM、LipozymeRMIM、LipaseAYS、LipaseAY-30G、LipaseAY、LipaseAK等，这些市售的酶制剂价格较贵，难以开展大规模的工业应用，所以，新型、质优价廉的脂肪酶的开发一直以来备受研究者关注。

脉孢菌属（Neurospora）隶属于真菌界（Fungi），子囊菌门（Ascomycota），核菌纲(Pyrenomycetes)，球壳目（Sphaeriales）。FDA组织认为脉孢菌是少数几种可食用的安全生物，是对医药、农业和环境很重要的一类生物，同时也是遗传学和生物化学研究中非常重要的模式生物。利用好食脉孢霉生产脂肪酶具有很好的应用前景。

发明内容

本发明的发明目的之一在于提供一种好食脉孢霉液体发酵制备脂肪酶的发酵方法。该方法所产的脂肪酶产量高、活性高，是一种胞外酶，有利于后续的纯化，而且安全性良好，制备成本比较低廉。

本发明的发明目的之二在于提供一种脂肪酶的纯化方法。该纯化方法操作步骤简单，回收率较高。

本发明所使用的菌种为好食脉孢霉（N.sitophila）菌株17号，保藏号为CGMCCNo.1836。该菌株是本申请人于1999年3月在中国北方酱类食品发酵中间产物酱块中分离、筛选得到的。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、以好食脉孢霉（N.sitophila）菌株17号为菌种，经过斜面培养、液体种子培养和液体发酵培养生产脂肪酶；

2、培养方法：斜面培养→液体种子培养→液体发酵培养

斜面培养采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA斜面），培养基含煮沸马铃薯汁20%W/V、葡萄糖2%W/V、琼脂2%W/V，pH自然，121℃灭菌30min，冷却接种后在28～30℃条件下培养3～5天。

种子培养基制作方法：将30g～50g麸皮加入到1000mL自来水中，浸泡过夜后过滤，留滤液，向滤液中添加1.5～3%W/V的蛋白胨，加热充分溶解后，调节pH至5.0即制得种子培养基。250mL三角瓶装50mL液体种子培养基，121℃灭菌30min后冷却，每瓶培养基接入10⁵～10⁶个孢子后在28～30℃、150r/min条件下培养48小时。

发酵培养基含10%W/V麸皮、6%W/V玉米黄粉，0.1%V/V的吐温-80，0.01%W/VKCl，培养基初始pH5.5～6.5，250mL三角瓶装50mL液体种子培养基，121℃灭菌30min后冷却，接入1%V/V的液体种子，在28～33℃培养48小时，经过离心得到上清液，上清液中脂肪酶活力为303.83U/mL。

、粗提纯纤溶酶：经过30%W/V饱和度硫酸铵盐析，4℃环境中静置过夜，再经10000r/min冷冻离心20min除去固形物，得到的上清液即为含脂肪酶的粗酶液。

、精提纯纤溶酶

采用色谱技术对粗酶液进行精提纯，依次采用以下方法纯化得到高纯度的脂肪酶：

A、Octyl-SepharoseFF疏水相互作用色谱

将粗酶液中的硫酸铵饱和度调到30%W/V，平衡液为含30%W/V饱和度硫酸铵的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，pH7.0。上样后用含30%～0W/V硫酸铵饱和度的缓冲液梯度洗脱，收集有脂肪酶活性组分；

B、Superdex75凝胶过滤色谱