[发明专利]一种口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方法，属于生物医药技术领域。

背景技术

口蹄疫的病原是口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV)，属于小RNA病毒科，病毒基因组为单股正链RNA，约由8500个核苷酸组成，具有7个血清型(A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3和ASIA1)和多种亚型。我国主要流行的是O型、C型和亚1型。各血清型的免疫无交叉保护，疫苗的配制往往随流行而变化。

目前使用的口蹄疫疫苗是经BHK-21细胞悬浮培养、经双乙烯亚胺灭活、乳化制备而成，有许多缺点，如需要生物安全水平3级以上的生产设施、病毒灭活不彻底、病毒逃逸的风险、难以区别动物感染和免疫、许多疫苗主种子批在细胞培养过程的适应性问题。为克服以上问题，研发新的口蹄疫疫苗成为必然。

病毒样颗粒疫苗保持了口蹄疫病毒灭活疫苗良好的免疫原性、高度安全性，可区别动物是否感染和免疫(DIVA)，其生产过程中避免使用活的口蹄疫病毒，可以无血清悬浮培养。

本发明发现在真核和昆虫细胞表达P12A，其P12A上有3个突变，形成75S病毒样颗粒，而不需3C的酶解。大多口蹄疫病毒样颗粒是用P12A3C在宿主细胞表达组装，由于3C对宿主细胞的毒性，使病毒样颗粒的产量低且病毒样颗粒结构不完整，因而造成病毒样颗粒产量低，生产成本高。本发明克服了筛选高水平稳定表达口蹄疫病毒样颗粒的细胞系较难的问题，解决了口蹄疫病毒颗粒在表达细胞系组装中消化宿主细胞蛋白而使工程细胞死亡的问题，从而增加了口蹄疫病毒的表达量，进而采用昆虫细胞，优选了高表达条件，特别是驯化了高pH条件下无血清培养高表达生产病毒样颗粒的昆虫细胞。

发明内容

疫苗免疫原性主要取决于其空间结构和构象，对于口蹄疫病毒样颗粒疫苗则取决于生产抗原的工程细胞稳定、高效表达重组蛋白且能够组装。本发明首先通过表达P12A(3个氨基酸位点突变，VP1K210E、VP1E83K、VP1C134S)，建立了类似自然标准75SFMDV病毒样颗粒和无血清悬浮培养BHK21细胞生产类似自然的75SFMDV病毒样颗粒的方法，此方法提高了口蹄疫病毒样颗粒的表达量，因而也提高了组装成熟病毒样颗粒的量。在上述基础上，本发明进一步提供了无血清悬浮培养驯化昆虫细胞SfHpH稳定高效生产口蹄疫病毒颗粒的方法，同时提供了生产重组口蹄疫病毒颗粒疫苗的检验和评估方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种口蹄疫病毒样颗粒疫苗，其特征在于，通过以下方法制备得到：将口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P12AcDNA序列克隆到真核表达载体中，所得的重组质粒转染哺乳动物细胞，使其表达口蹄疫病毒衣壳蛋白并组装成口蹄疫病毒样颗粒，纯化、乳化，即得；

其中，所述的衣壳前体蛋白P12A的结构蛋白VP1在原始口蹄疫病毒VP1蛋白基因的基础上进行了以下位点的突变：Glu83→Lys，Ser134→Cys，P12A连接处Lys210→Glu。

一种口蹄疫病毒样颗粒疫苗，其特征在于，通过以下方法制备得到：将口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P12AcDNA序列克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1中，所得的重组杆状转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，得到重组杆状质粒，重组杆状质粒转染Sf21昆虫细胞产生感染性重组杆状病毒，重组杆状病毒转染SfHpH细胞，使其表达口蹄疫病毒衣壳蛋白并组装成口蹄疫病毒样颗粒，纯化，乳化，即得；

其中，所述的衣壳前体蛋白P12A的结构蛋白VP1在原始口蹄疫病毒VP1蛋白基因的基础上进行了以下位点的突变：Glu83→Lys，Ser134→Cys，P12A连接处Lys210→Glu；所述的SfHpH细胞为无血清培养基培养pH7.0-7.4适应的昆虫细胞Sf21。

在本发明中，优选的，所述的真核表达载体为pTT5或pV1JNS；所述的哺乳动物细胞为BHK-21细胞。

在本发明中，优选的，所述的SfHpH细胞采用以下方法驯化得到：Sf21细胞首先用pH6.0的无血清培养基完全换液，之后每隔2-5天用调节好pH的无血清培养基换液，经过2月连续从pH6.0到7.4，每次提高0.2pH单位，不断提升Sf21细胞的pH压力选择，获得了无血清培养基培养pH7.0-7.4适应的稳定的昆虫细胞Sf21，即为SfHpH细胞。