[发明专利]一种表达PPV VP2基因和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒株

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达PPVVP2基因和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒株。

背景技术

猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一，可引起胚胎早期死亡，木乃伊胎，死胎，不孕不育和延迟发情，同时还会引起仔猪皮炎症状、非化脓性心肌炎和消瘦性综合征。并常与猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪圆环病毒等其他病原混合感染而加重了其危害，给养猪业带来巨大的经济损失。

猪伪狂犬病毒也是引起猪繁殖障碍的主要病原之一。其危害主要表现为母猪流产，产死胎、木乃伊胎及新生仔猪死亡等综合征，临床以产死胎为主。伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)基因组庞大，大小为150kb，含TK、gI、gG、gL等多个非必需基因，具有足够的空间允许外源基因的稳定插入，其容量可高达40kb，并且重组病毒在增殖的同时可稳定表达外源基因，从而提供对伪狂犬病毒和其它相应传染病的抵抗力。PRV具有病毒稳定、无致癌性、免疫原性持久，能够同时激发细胞免疫和体液免疫等优点，具有一个优良活病毒载体的基本特征，因此PRV适合基因工程活载体疫苗的研究和开发，已有多种病原利用PRV病毒载体得到表达。

白细胞介素18(IL-18)能诱导IFN-γ大量分泌表达，促进T细胞增殖及Th1细胞的免疫应答，增强NK细胞的杀伤活性，抑制Th2类细胞因子的生成，具有广泛的生物学效应，在免疫调节、抗肿瘤、抗病原微生物感染中具有十分重要的作用。IL-18作为一种新发现的天然免疫调节剂，目前已被公认为是一种可以替代传统疗法的新型治疗剂和有效的免疫佐剂，已经成为研究热点。据报道IL-18在猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗、猪圆环病毒2型DNA疫苗、新城疫活疫苗等多种动物疫苗中作为免疫佐剂，起到了一定的免疫增强作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种表达PPVVP2基因和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒毒株，分类命名：表达PPVVP2基因和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒PRV-PPV-IL18PGVP218，拉丁文学名：Herpesviridae。保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称：CCTCC，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2013年11月18日，保藏编号CCTCCNO：V201347。

本发明的技术方案是：一种表达PPVVP2基因和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒毒株，其特征在于：重组猪伪狂犬病毒(Herpesviridae)毒株，CCTCCNO：V201347。

本发明的有益效果是：本发明利用猪伪狂犬病毒作为活病毒载体能够携带外源基因的特点，将猪细小病毒的主要抗原基因VP2基因片段插入猪伪狂犬病毒非必需基因区内，使两种引起猪繁殖障碍的病原结合在一起，构建能够同时预防PRV和PPV的重组病毒。同时插入新型细胞因子IL-18作为分子免疫佐剂，以期考察IL-18在重组疫苗中的免疫增强作用效果。为方便筛选重组病毒，需要筛选标记，GFP是一种吸收蓝光或紫外光后发出绿色荧光的天然蛋白质，不需要任何外源性底物和辅助因子，无毒、无污染、稳定，被广泛应用于分子生物学研究，故在构建时插入了绿色荧光蛋白(GFP)基因作为筛选标记。

本发明以PPVHP/104株DNA为模板，PCR扩增PPVVP2蛋白主要抗原基因，连接到18-T载体中，构建了重组质粒pMD-VP2。PCR扩增猪IL-18基因，利用重组技术将猪IL-18基因定向插入到实验室构建的含部分PRV基因，且带EGFP筛选标志的PRV转移质粒pG中，构建重组质粒pG18。从重组质粒pMD-VP2中获取VP2基因片段，将其定向插入到质粒pG18中，得到重组转移质粒pG18-VP2。将pG18-VP2与PRV弱毒株DNA共同转染猪睾丸细胞(ST细胞)，得到能够表达PPVVP2蛋白和IL-18的重组伪狂犬病毒PGVP218。以小鼠为实验动物，评价重组病毒的免疫原性，并与不含IL-18的重组病毒免疫效果进行比较。为在生产上同时预防猪细小病毒病和猪伪狂犬病提供新的思路和试验依据，同时也为探索猪IL-18对重组病毒的免疫增强奠定基础。